大粒径脂肪颗粒分选

大粒径脂肪颗粒分选技术被广泛用于分离直径高达 200 μm的细胞。分选需要使用配备大喷嘴的专用流式细胞仪，并且能够在细胞分选过程中使用低压来减少剪切力。传统的流动分选仪不是为脂肪细胞分选而设计的，因为它们的喷嘴尺寸小，剪切力高，这可能会在细胞分选过程中导致脂肪细胞溶解。单细胞流式分选将通过在单细胞水平上识别基因表达、蛋白质组成和代谢特征，使人们能够更深入地了解脂肪细胞的异质性。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. 分离脂肪细胞

1.1 在室温下，将 1g 左右的白色脂肪组织 (WAT) 收集在含有 25 mL 脂肪细胞培养液 50 mL 锥形管中。

1.2 在室温下，将 WAT 放入一个 6 cm的皿中，用手术刀轻轻切成 2-5 mm的碎片。

1.3 将所有组织碎片转移到一个 50 mL 的锥形试管中，内含 5 mL 3 mg/mL 的胶原酶溶液（预热至 37 °C）。

1.4 在 37℃ 下孵化 30-40 分钟，每 5 分钟手动旋转管一次。

1.5 将胶原酶消化后的WAT的悬浮液过 100 μm 细胞筛，收集到 50 mL 的锥形管中。胶原酶消化后的 WAT 通常含有小组织碎片和不透明细胞悬浮液的混合物。如果出现清油通常是消化过度的迹象，应该避免。使用 100 μm 细胞筛可能会导致大脂肪细胞的丢失。

1.6 在室温下用 10 mL 脂肪细胞培养液清洗细胞筛。

1.7 轻轻混合装有消化后的组织悬液的 50 mL 试管，在室温下孵化 10 分钟。富含脂肪的脂肪细胞将漂浮在管子的顶部。

1.8 用 1 mL 的移液器收集 1-2 mL 离心管顶层的脂肪细胞，然后转移到 包含 10 mL 的预热的脂肪细胞培养液的 15 mL 的锥形管中。

1.9 按照步骤 1.7 将 15 mL 的试管混合和孵化，然后收集顶部 1 mL 洗净的脂肪细胞，然后转移到一个新鲜的 15 mL 的试管中，其中包含 10 mL 预热的脂肪细胞培养液。

1.10 重复清洗一次，将顶部 1 mL 的悬浮液转移到空管中。

2. 标记并固定脂肪细胞

2.1 将以下物质加入洗净的脂肪细胞中，轻轻混合: 250 μL 10 μM BODIPY-C12；10 μL 100× 钙黄素；2 μL 10 mg/mL Hoechst 33342。

2.2 在 37 °C 下温和搅拌并避光孵育 15-30 分钟。

2.3 将试管静置 5 分钟，让脂肪细胞漂浮。用 200 μL 移液管或针头除去脂肪细胞下面的大部分培养基。

2.4 向脂肪细胞中加入 10 mL 脂肪培养基，室温孵育 10 min，稀释荧光标记混合物并终止反应。

2.5 重复 2.4 一到两次，以确保荧光染料完全从培养基中去除。

2.6 从顶部部分收集脂肪细胞 (0.5-1 ml)，转移到含有 9 ml PFA 的 15 ml 锥形管中。

2.7 在室温下避光培养 15-20 分钟。

2.8 用 PBS 洗涤三次。

3. 分析和分类脂肪细胞

3.1 打开样品阀和护套阀，使连接鲁尔锁注射器到流动池的油管充注，直到油管充满护套液 (PBS)。

3.2 调整鲁尔锁定注射器的旋转，使其每 2-3 秒旋转 180°。

3.3 将脂肪细胞装入 Luer-lock 注射器，浓度为 1000-2000 个细胞/mL。

3.4 选择“重新填充注射器”并按照说明操作。

3.5 总共分析 5,000-10,000 个对象，然后按 Abort。

3.6 从直方图中选择要排序的区域 (在获取/分发窗口的排序门部分下找到)。

3.7 从选定的区域选择一些脂肪细胞分选到一个容器中。

3.8 用少量 PBS (30-50 μL) 填充 96 孔板的孔，将板置于板架上。

3.9 在 FlowPilot 主菜单的设置选项卡下，转至平板，然后选择校准平板。

3.10 将重合模式设为 Pure, no doubles。

3.11 按 Fill Plate 键。

4. 显微镜分析脂肪细胞

4.1 将 50-100 μl 培养基中的每个分类脂肪细胞转移到显微载玻片上进行成像。使用以下两种方法之一对脂肪细胞成像：

a. 倒转载玻片，通过表面张力使培养基液滴附着在玻璃表面。脂肪细胞将浮到顶部，可使用倒置或直立显微镜成像。

b. 将液滴 (最终体积小于 100 μL) 转移到载玻片上，并轻轻盖上圆形盖玻片。为避免吸力导致细胞裂解，在载玻片和盖玻片之间放置一个薄垫片。