双荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测是以荧光素 (luciferin) 为底物来检测萤火虫荧光素酶 (Firefly Luciferase) 活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素氧化成 oxyluciferin，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光 (bioluminescence)，可通过荧光测定仪设备测定，常应用于 miRNA 靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。海肾荧光素酶 (Renilla Luciferase) 可 ATP 非依赖性地氧化腔肠素 (coelenterazine) 产生荧光，常用作双荧光检测的内参。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. 将双荧光报告基因构建入不同质粒或同一质粒中。

2. 将质粒转染入目标细胞。

3. 细胞培养一天后以冰冷 PBS 清洗一遍，加入 80-100 µL lysis buffer。

4. 冰上被动裂解 30 min。

5. 4 ℃，12000 rpm 离心 10 min。

6. 吸取上清 10 µL 于 luciferase 专用 96 孔板。

7. 依次加入50 µL Firefly Luciferase Buffer (FB) 与 50 µL Renilla Luciferase Buffer (RB)。

8. 亮度计下检测 550-570 nm 和 480 nm 的荧光强度。

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1. 需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差。

2. 室温反应。反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

3. 荧光素酶的半衰期一般约 30 min，加完底物后可立即检测，尽量在 30 min内完成。

4. 底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物 -20 ℃ 保存；海肾荧光素酶底物推荐 -80 ℃ 保存。

5. 荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，复孔之间的数值有一定差异是正常的，一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。