RIPA Lysis Buffer (Strong) 

RIPA 裂解液 (强)

MCE RIPA 裂解液 (Radio Immunoprecipitation Assay Lysis Buffer)是一种传统的细胞、组织快速裂解液，根据其裂解强度大致可以分为强、中、弱三类。RIPA 裂解液适用于 Western Blot (WB)、免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 等实验，例如大部分抗原表位的检测、胞浆磷酸化蛋白和细胞核转录因子检测等。

MCE RIPA 裂解液 (强)的主要成分为 50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及 sodiumorthovanadate，EDTA 等。RIPA 裂解液 (强) 不含全面的蛋白酶或磷酸酶抑制剂。为有效的防止蛋白降解，建议添加全面的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

-20°C，1 年

1. 裂解细胞样品

1.1 取适当量的裂解液，如有需要，在使用前数分钟内加入 Protease Inhibitor Cocktail (HY-K0010)，Phosphatase Inhibitor Cocktails (HY-K0021、HY-K0022、HY-K0023) 或 Deacetylase Inhibitor Cocktail (HY-K0030)，具体操作可参考相关产品说明书。准备好置于冰上备用。

1.2 贴壁细胞 去除培养液，用预冷的 PBS、生理盐水或无血清培养液洗 2 遍 (洗去血清中 IgG 干扰对 IP 和 Co-IP 实验是有益的，但对 WB 可能并非必要)。按照 6 孔板每孔加入 150-250 μL 裂解液的比例加入预冷的裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。冰上放置 5-10 分钟，期间剧烈震荡 3-4 次，每次 30 秒，以充分裂解。

悬浮细胞 . 离心收集细胞，弃上清，用预冷的 PBS、生理盐水或无血清培养液洗 2 遍 (洗去血清中 IgG 干扰对 IP 和 Co-IP 实验是有益的，但对 WB 可能并非必要)。按照 6 孔板每孔加入 150-250 μL 裂解液的比例加入预冷的裂解液，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必须分装成 0.5-5 × 10⁶ cells/管，然后再裂解。冰上放置 5-10 分钟，期间剧烈震荡 3-4 次，每次 30 秒，以充分裂解。充分裂解后，14,000 g 低温离心5 分钟，取上清，即可进行后续的WB、IP 等操作。也可用液氮速冻后放 –80°C 长期保存。

注：一般每 0.5-5 × 10⁶ 细胞用 1 mL 的 RIPA 裂解液裂解。细胞数量较高时，可加大裂解液用量

2. 裂解组织样品

2.1 取适当量的裂解液，如有需要，在使用前数分钟内加入 Protease Inhibitor Cocktail (HY-K0010)，Phosphatase Inhibitor Cocktails (HY-K0021、HY-K0022、HY-K0023)或 Deacetylase Inhibitor Cocktail (HY-K0030)，具体操作可参考相关产品说明书。准备好置于冰上备用。

2.2 将组织置于小皿中，冰上操作，剪切成细小的碎片。

2.3 按照每 20 mg 组织加入 150-250 μL 裂解液的比例加入预冷的裂解液。如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

2.4 用玻璃匀浆器冰上均质 30-50 次，或超声破碎细胞，每次 30 秒，3-4 次，每次间隔 1 分钟，置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于 90%，同时组织已经完全裂解，没有明显的小组织块。

2.5 将匀浆物转移到离心管，冰上放置 5-10 分钟，期间剧烈震荡 3-4 次，每次 30 秒，以充分裂解。

充分裂解后，14,000 g 低温离心 5 分钟，取上清，即可进行后续的 PAGE、WB 和免疫沉淀等操作。

注：每 20 mg 冻存的小鼠肝脏组织用200 μL 本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为 15-25 mg/mL，不同状态的不同组织有所不同。