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MCE一作论坛|武大医学院张博分享Cell成果:一种高效精确的基因组结构编辑工具

讲师:张瑞文博士 武汉大学医学研究院
直播内容
分享一种名为Amplification Editing (AE)的方法,以可编程的方式精确高效地复制从小片段到染色体大部分区域的基因组序列,是一种高效精确的基因组结构编辑工具,将精准复制的范围从单个基因位点扩展到染色体层面。
本次直播将为您带来:
1.AE可精准高效的扩增20 bp到100 Mb
2.在扩增8 kb以下时,可形成串联重复
3.AE可上调非编码RNA和基因的表达
4.AE在胚胎干细胞和原代细胞中实现精准扩增
直播答疑
Q:

AE具体是怎么设计的呢?

A:
首先,需要设计了一对pam-out的pegRNA靶向想要的扩增区域,PE蛋白在pegRNA的引导下,对靶向区域产生一个切口。同时,PE蛋白会以pegRNA的RTT为模版,逆转录形成3’flap。两个3’ flap完全互补(3‘flap的长度可在30-50bp),退火后作为新DNA链合成的引物,以原始基因组的一条链作为模板,进行新DNA链合成。合成停止在PE蛋白切口的位置号。最后的编辑产物为精确扩增目标区域,并在其间插入flap的序列。
Q:

AE上调非编码RNA的表达效率如何?能有多少倍呢?

A:
在K562细胞中,我们对MIR的关键颈环结构(~200bp)进行了靶向扩增,编辑效率在100%以上,说明发生了多次编辑。与WT细胞相比,编辑后细胞的miR-21表达水平上升了4-7倍。