干货分享 | 揭秘! 生物素化蛋白及其应用

生物素，不仅是生命活动中不可或缺的辅酶，更是现代生物技术领域的明星工具。小小身量，大大用途。跟萌 Cece 一起来认识这个微小而强大的分子吧~

生物素 (Biotin)，也称为维生素 H、维生素 B7 或辅酶 R，244 Da 大小，是人体五种羧化酶的辅酶，可以高亲和力地结合亲和素 (Avidin)、链霉亲和素 (Streptavidin, SA)。生物素是一种相对较小的分子，它可以与许多蛋白质结合而不会显著改变其生物活性，且一个蛋白还可以结合几个生物素分子，继而通过结合亲和素，大大提高了分析的灵敏度。

图 1. 生物素的分子结构

亲和素 (Avidin) 是一种来源于蛋清，由四个相同亚基组成的，高度稳定的糖蛋白，亲和素-生物素通过极强非共价键结合 (K_d≈10^-15M)，这比抗原-抗体相互作用高 10³-10⁶ 倍^[1]。

最广泛使用的亲和素类似物是链霉亲和素 (Streptavidin, SA)，链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白，分子量为 53 kDa。和亲和素一样能够结合 4 个生物素，链亲和素-生物素复合物的 K_d 值为 ≈10⁻¹⁴M，其强度接近共价键。与亲和素相似，链霉亲和素对变性剂、温度、pH 值和蛋白酶也具有很强的耐受性。

亲和素-生物素相互作用是自然界中最强的非共价相互作用之一。因此，亲和素及其类似物被广泛用于多种应用，包括生化检测、诊断、亲和纯化和药物递送等^[2]。

生物素化/生物素标记是将生物素共价偶联到目标分子上。由于生物素分子体积小，通常不会干扰目标分子的自然功能。在蛋白质生物学中，生物素化蛋白增强了蛋白质的“可操纵性”，使其易于检测、纯化或固定，以及多聚化或桥联分子。

生物素化蛋白有两种主要方法：化学标记法和酶促法。

▐  化学标记法

通常通过生物素化试剂与蛋白质表面上的特定官能团（如氨基、巯基、羧基）反应来完成。常见的生物素化试剂例如 1）通过 NHS-酯与蛋白质表面的赖氨酸残基上的氨基反应，一个蛋白质分子会被标记上多个生物素分子；2）马来酰亚胺-生物素 (Biotin-Maleimide) 与半胱氨酸残基的硫醇，形成稳定的硫醚键；3）碳二亚胺 (EDC) 可将生物素与蛋白的羧基连接^[3][4]。

表 1. 不同生物素标记蛋白

▐  酶促生物素化

Avi-Tag 生物素标记：Avi 标签是一种常用于生物素标记的特殊肽标签，由 15 个氨基酸 (GLNDIFEAQKIEWHE) 组成，它能在体内 (In vivo) 或体外 (In vitro) 通过来源于大肠杆菌的生物素化酶（BirA）在赖氨酸残基共价结合一个生物素，从而实现生物素化。当在细胞中共表达 BirA 和 Avi 标记的目标蛋白时，可以在体内高效地进行生物素化，避免额外添加 BirA 酶，高效省时，但这样的方式可能会导致表达水平不高，或是标记蛋白在储存过程中逐渐失去生物素。在获得可溶性目标蛋白效率低时 (例如蛋白质在细菌中表达后形成包涵体的情况)，或者当使用尚未建立高效生物素标记的表达系统，可选择重组 BirA 酶在催化体外生物素化，但标记和纯化效率可能受到底物和酶浓度的影响^[5][6]。

通过在目标蛋白质上添加 Avi 标签，可以实现在特定位点上的生物素化，便于进一步的检测、分离或固定操作。这种方法在蛋白质研究、抗体开发和细胞标记等应用中具有重要价值。

图 2. 通过 Avi-Tag 标签使蛋白生物素化^[7]

▐  检测与分析

生物层干涉法 (BLI)

BLI 是一种光学生物传感技术，用于实时、无标记分析生物分子相互作用。它可用于中高通量的动力学分析、分析物检测和定量。当目标分子被生物素化后，可以通过生物素与链霉亲和素的高亲和力，固定在 BLI 传感器的表面，这样就能够实时检测目标分子与配体的结合和解离过程。

表面等离子共振 (SPR)

生物素化蛋白质在 SPR 中常用作标记分子，通过生物素和链霉亲和素之间的高亲和力结合，使得生物素化蛋白能够牢固固定在 SPR 传感器表面，然后与其他分子 (如配体或抗体) 反应。

酶联免疫吸附实验 (ELISA)

链霉亲和素-生物素系统 (Streptavidin-Biotin System, SABS) 显著提升了 ELISA 检测灵敏度。1) 凭借其高亲和力，确保了反应的结合稳固且特异；2) 使用小分子生物素替代酶标记抗体，降低了空间位阻。3) SABS 与 ELISA 结合形式多样，如用于固相化抗体或抗原，能增加包被量并充分暴露结合位点，促进免疫反应。4) 每个亲和素能结合 4 个生物素，有效放大了 ELISA 终反应，通过生物素标记抗体、受体、配体蛋白与亲和素-酶结合物等，增强信号，提高检测灵敏度。

 图 4. 链霉亲和素-生物素系统用于抗原检测^[2]

免疫沉淀和流式细胞术

SABS 也被应用于免疫沉淀 (IP) 和细胞表面标记、荧光细胞分选 (FACS) 等，详细见往期推文：干货分享 | "难分难舍" 的链霉亲和素-生物素系统 

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