PKH 67 

PKH67 is a fluorescent cell binding dye with green fluorescence. PKH67 can stain the cell membrane and the Ex/Em is 490/502 nm. PKH67 is often used in combination with the non-specific red fluorescent dye PKH26 (Ex/Em=551/567 nm) to label cells, detect cell proliferation in vitro, and trace cells in vitro and in vivo^[1][2].

1. 染色液制备
（1）从冰箱中取出 PKH 67 试剂，静置几分钟至室温，或者 37°C 水浴片刻后，离心盛放 PKH 67 的管子，开盖前请务必离心几分钟让试剂充分落⼊管底后才能开盖。
（2）根据需要检测的细胞样品数，⽤稀释液将探针 10 倍稀释，再用合适的溶液(如：无血清培养基，HBSS 或 PBS)将 PKH 67 母液 25 倍稀释，配制成染色工作液。最佳⼯作液浓度请根据不同细胞和自身的实验体系来调整。⼀般细胞使⽤按试剂盒中的⺟液的终浓度 250 倍稀释即可，有些细胞可能需要适当增加浓度。

2. 细胞染色
（1） 将制备好的待测细胞用 100μL 染色工作液重悬，至细胞浓度大约 10⁷/mL。也可以进行原位染色，染色液足够覆盖细胞即可。
（2） 在 2-8 °C 培养细胞 15-30 分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。
（注：建议待标记细胞在染色工作液中于 37°C 孵育 5 min，再于 4°C 孵育 15 min。低温孵育可降低细胞对染料的内吞作用，有助于染料对质膜的标记，并且降低染料定位细胞质囊泡的可能性。）
（3） 离心后去上清，收集细胞，用 PBS 或无血清培养基洗涤细胞 1-2 次，最后加入 PBS 或无血清培养基重悬细胞。
（4） 取 500 μL 细胞悬液，用流式细胞仪检测。Ex/Em=490/502 nm。
（5） 随后还可按照细胞的正常培养方法进行培养。
（6） 可以在荧光显微镜下直接观察标记效果，也可以在培养适当时间后再用流式细胞仪检测细胞增殖，或用于其他特定实验目的的细胞荧光示踪。

注意事项
（1）染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。
（2）配制的 PKH 67 母液极易水解，建议分装保存，-20°C 冷冻干燥保存。
（3）PKH 67 工作液应现配现用，不能提前配制，因为 PKH 67 吸水会分解，影响染色效果。
（4）PKH 67 易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。
（5）PKH 67 荧光染色剂为乙醇溶液，在 4°C、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以 37°C 水浴片刻至全部融解后使用。
（6）不同的细胞种类标记后可以示踪的代次或时间差异较大，请根据实际情况或参考文献进行检测。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

257277-27-3

液体

Light yellow to yellow

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-80°C, protect from light

• [1]. Shi J, et al. A genome-wide CRISPR screen identifies WDFY3 as a regulator of macrophage efferocytosis. Nat Commun. 2022 Dec 24;13(1):7929.  [Content Brief]

  [2]. He L, et al. Intelligent manganese dioxide nanocomposites induce tumor immunogenic cell death and remould tumor microenvironment[J]. Chemical Engineering Journal, 2023: 141369.