神经元细胞分化

使用转录因子对人类诱导多能干细胞 (iPSC) 或神经祖细胞进行定向神经元分化，可以实现成熟和功能性神经元的快速和高度可重复的分化。转录因子 Neurogenin-2 (NGN2) 的外源表达被广泛用于诱导生成不同的神经元细胞，这些神经元已用于神经发育研究、疾病建模、药物筛选和神经元替代疗法。本实验方法为 iPSC 与稳定整合的强力霉素诱导型 Ngn2 (例如 i3Ns) 的分化^[1]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

• 方法

1. 培养 iPSC

1.1. 在铺板或菌落构成少于约 20 个细胞时,用 ROCK 抑制剂培养 iPS 细胞。

1.2. 通常每隔一天更换培养基，除非细胞密度超过 50%，否则每天更换 StemFlex 培养基。

1.3. 当细胞密度 60-75% 时传代细胞。细胞密度不应超过 90%。

2. 第 0-3 天：预分化

2.1. 用在 Knockout DMEM 中稀释的基质凝胶包被板。包被至少 30 分钟 （或O/N）。包被板可以在 37℃ 的培养箱中持续 14 天。

2.2. 从 iPSC 中吸出培养基并用 DPBS 洗涤。

2.3. 加入 accutase 细胞消化液，在 37℃ 孵育 3 分钟，如有必要，再孵育 7 分钟。

2.4. 轻柔分离细胞，并用DPBS收集在Eppendorf管中。

2.5. 200 x g 离心细胞 5 分钟，重悬于 N2 预分化培养基中。

2.6. 计数细胞并将取所需细胞量到 Eppendorf 管中，离心弃上清，重悬于 N2 预分化培养基中，并板到 Matrigel 包被的细胞培养容器上进行预分化。

2.7. 在第 0-3 天预分化期间每天进行预分化培养基半换液，或在 1 天或第 2 天进行全换液。

2.8. 进入分化阶段时，细胞最好处于单细胞悬液状态。可使用细胞过滤器过滤。

2.9. 预分化的细胞可以在 10% DMSO + N2/B27 分化培养基中冻存 （也可用预分化培养基中冻存）。

3. 第 3 天：分离和铺板预分化的 iNeurons

3.1. 吸取培养基，并用 DPBS 清洗。

3.2. 加入 accutase 细胞消化液并在 37 ℃ 下孵育 3 分钟；如有必要，再孵育 7 分钟。

3.3. 轻柔分离细胞，并用 DPBS 收集在 Eppendorf 管中。

3.4. 200 x g 离心细胞 5 分钟。

3.5. 小心吸去 DPBS/accutase 溶液，并重悬于经典的 N2/B27 分化培养基中。

3.6. 计数细胞，稀释至适当密度，并将铺板于 PDL 包被的细胞培养容器上。

3.7. 剩余细胞可以在预分化培养基加入 10% DMSO 冻存。

4. 第 4 天及以后：神经元分化。

4.1. 铺板后第 3 天完全培养基发生变化，观察到碎片。

4.2. 枪头紧挨孔壁，不要碰到孔板的底部。

4.3. 每周至少更换一次经典的 N2/B27 分化培养基，不使用 dox 或 rock 抑制剂。

4.4. 密切关注。至少等待一周，最好在 2 周后使用。

1. 试剂在 4 ℃ 下保存最多 4 周，如果需要长期保存，不要冻融超过 3 次。

2. 有时预分化细胞需要很长时间才能在第 3 天从培养板上分离出来。重要的是铺板细胞是单细胞。