荧光激活细胞分选实验方法

荧光激活细胞分选 (FACS) 是一种特殊类型的流式细胞术，用于根据每个细胞的特定光散射和荧光特征（来自特定标记）将异质细胞混合物分选和分析为不同的亚群。该技术可用于分离细胞群的可测量参数数量巨大——从简单的表面免疫表型到代谢功能、细胞周期状态、氧化还原状态和 DNA 含量分析等等。 FACS 已广泛应用于生物医学研究以及临床诊断和治疗^[1]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

用于流式细胞术分析的细胞通常来自 3 个主要来源：贴壁或悬浮培养，冷冻保存的样品，全血或血沉棕黄的实体组织，例如骨髓、脾脏、肠等

无论来源如何，最终的细胞制备应该：1. 无团块和死细胞碎片的均匀单细胞悬液；2. 密度为每 mL 10⁶-10⁷ 个细胞；3. 悬浮在合适的染色缓冲液中。

通过 Ficoll 梯度离心或 RBC 裂解全血或非贴壁培养细胞从全血中分离的 PBMC 可用于流式细胞术分析。贴壁培养细胞或存在于实体器官中的细胞应首先在流动分析之前分别使用酶消化或机械解离组织制成单细胞悬液。应遵循机械过滤，以避免不必要的仪器堵塞或较低质量的流量数据。

• 表面抗原的直接免疫染色

1. 使用适当的方案制备单细胞悬液，并在染色缓冲液中将细胞浓度调节至 10⁷ 个细胞/mL。

2. 根据需要将 100 μL 细胞悬液分配到尽可能多的染色管中 (未染色对照，补偿对照，可选同种型和 FMO 对照以及测试样品)。

3. 将抗体的优化稀释液添加到相应的试管中，并在 4°C (冰上) 下在黑暗中孵育 30 分钟。 用冰冷的 PBS 以 300-400 × g 洗涤细胞一次，然后重新悬浮在 100-200 μL FACS 缓冲液/PFA 固定缓冲液中。

4. 在4°C 的黑暗中储存，最好在 24 小时内获取。

• 表面抗原的间接免疫染色

1. 使用适当的方案制备单细胞悬液，并在染色缓冲液中将细胞浓度调节至10⁷ 个细胞/mL。

2. 根据需要将 100 μL 细胞悬液分配到尽可能多的染色管中 (未染色对照，补偿对照，可选同种型和 FMO 对照以及测试样品)。

3. 将一抗的优化稀释液添加到相应的试管中，并在 4°C (冰上) 下孵育 30 分钟。

4. 用冰冷的 PBS 以 300-400 × g 洗涤细胞一次，并重新悬浮在 100 μL 染色缓冲液中。

5. 以适当的稀释度加入特异性二抗，并将细胞在 4°C (冰上) 在黑暗中孵育 30 分钟。

6. 用 300-400 × g 的冷 PBS 洗涤细胞一次，然后重新悬浮在 100-200 μL FACS 缓冲液/PFA 固定缓冲液中。

7. 在 4°C 的黑暗中储存，最好在 24 小时内获取。

• 细胞内抗原的一般免疫染色程序-甲醇透化

1. 进行表面染色。

2. 将染色细胞在 0.5-4% PFA 中以 10⁷ 个/mL 的浓度分离。为细胞内染色对照准备未染色的等分液。

3. 将细胞固定在冰上 10-30 分钟，远离光线。

4. 以 300-400 × g 洗掉固定剂，然后缓慢加入冰冷的 100% 甲醇，轻轻涡旋。

5. 将细胞在冰上孵育 30 分钟，远离光线。

6. 以 400-500 × g 洗涤甲醇，并将细胞重新悬浮在 100 μL 染色缓冲液中。

7. 根据需要将 100 μL 细胞悬液分配到尽可能多的染色管中 (未染色对照，补偿对照，可选同种型和 FMO 对照以及测试样品)。

8. 将一抗的优化稀释液添加到相应的试管中，并在 4°C (冰上) 下孵育 30 分钟。

9. 用冰冷的 PBS 以 400-500 × g 洗涤细胞一次，并重新悬浮在 100 μL 染色缓冲液中。

10. 以适当的稀释度加入特异性二抗，并将细胞在 4°C (冰上) 在黑暗中孵育 30 分钟。

11. 用 400-500 × g 的冷 PBS 洗涤细胞一次，然后重新悬浮在 100-200 μL FACS 缓冲液/PFA 固定缓冲液中。

12. 在 4°C 的黑暗中储存，最好在 24 小时内获取。

• 染料外排染色-碘化丙啶 (PI) 染色

1. 收获细胞并用 PBS 洗涤一次。

2. 将细胞重悬于染色缓冲液中，浓度为 10⁷ 个细胞/mL。

3. 每 5 μL 细胞悬液加入 100 μL PI 染色剂，轻轻混合，使其在黑暗中停留 1 分钟。

4. 洗掉染料并将细胞重新悬浮在适当体积的染色缓冲液中。

• DNA 含量或细胞周期分析

1. 收获细胞并在 PBS 中洗涤一次。

2 将细胞重悬于染色缓冲液中，浓度为 10⁷ 个细胞/ mL。

3. 将 500 μL 细胞分装到单独的管中 (预冷)，并轻轻涡旋滴加冰冷的 70% 乙醇。

4. 将细胞在冰上保存 1 小时。

5. 在 PBS 中以 400-500 × g 洗涤细胞两次，持续 10 分钟。

1. 制定专门的梯度培养基，以丰富不同的粒细胞群体。

2. 如果细胞在 96 孔 U 型或 V 型底板中染色，首先应设置洗涤程序，以最大限度地去除未结合的一抗。

3. 对分泌细胞因子进行染色时，在孵育期间按制造商推荐的浓度添加 brefeldin A 或 monenin。

4. 留出一些未受刺激的等分作为未染色的对照和染色的基线对照。