基因编辑

基因编辑（Gene Editing）是一种分子技术，通过基因删除、插入或转换来修改基因组内的特定位点，以研究功能未知的基因或进行基因治疗。由于修改后的遗传信息会遗传给后代，基因编辑经常被用来改变生物体的生物学性状，以建立新品种。

已开发几种基因编辑技术，其中包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR/Cas9 系统。所有这些技术都使用特定的核酸酶或核酸酶复合物来识别和切割特定靶位点的 DNA，通过 DNA 修复机制实现 DNA 敲除或替换。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. sgRNA 和 genotype primers 的设计合成

1.1 sgRNA设计：对靶基因序列进行分析，筛选合适的靶位点，每个靶位点设计 1 条 sgRNA。通常，将 Cas9 靶向编码功能蛋白结构域外显子的 sgRNA 比单纯靶向 5' 外显子更有可能消除基因功能。

1.2 PCR 引物设计：根据靶位点设计 PCR 引物，用于后续靶位点 DNA 突变检测。

2. 载体构建

2.1 根据设计的 sgRNA 序列，合成 Oligo DNA。酶切带有 Cas9 基因的空载体（带有荧光标签（GFP）和筛选基因（嘌呤霉素））得到线性化质粒，混合 Oligo DNA 与线性化空载体，以 T4 连接酶连接，添加 buffer 与 ddH₂O，16℃ 连接过夜。

3. 质粒验证

3.1 将连接产物转入 DH5α 大肠杆菌，37℃ 培养过夜。挑选单菌落进行扩增，提取质粒，进行酶切鉴定。

3.2 对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，挑选具有正确大小的酶切产物进行测序验证。

4. 质粒提取与质量检测

4.1 将验证的质粒转入新的 DH5α 感受态大肠杆菌中，37℃ 培养过夜。挑取单菌落进行扩增培养，提取质粒。检测内毒素；进行其吸光度检测（260 nm/280 nm的比例在1.8~2.0）；并通过琼脂糖电泳检测质粒的完整性。

5. 转染前

5.1 转染前 1 天，将生长状态良好的 293T 细胞铺在 6 孔板中，每个孔的细胞约 1.0 x 10⁵ -3.0 x 10⁵ 个。细胞培养箱中培养过夜，至 90%~95% 的细胞密度。

6. 细胞转染

6.1 将转染所需试剂在 37℃ 水浴锅中预热（包括 Opti-MEM、质粒）。

6.2 取两个离心管，一管加入 4 μg 质粒和 100 μL Opti-MEM，另一管加入 4 μL Lipo-2000 和 100 μL Opti-MEM。静置 5 min 后，混匀，静置 20-25 min。加入到 6 孔板中，每孔 200 μL，轻轻混匀，继续培养。

7. 单克隆筛选及鉴定

7.1 转染 24 h 后，在培养皿中加入终浓度为 2~3 μg/mL 的嘌呤霉素进行筛选，一般筛选 2~3 天。

7.2 用预热的 PBS 洗去漂浮的死细胞及血清后，加入 200 μL 1×胰蛋白酶进行消化。

7.3 加入 2 mL 10% 血清的培养基终止消化，然后转移到无菌的 15 mL 离心管中。

7.4 将细胞以 800g 离心 3 min。

7.5 将细胞沉淀重悬于 5 mL 10% 血清的培养基中。

7.6 计算血细胞计数器中活细胞的数量，以确定细胞密度。使用锥虫蓝排除死细胞，死细胞会吸收染料并变成蓝色。

7.7 在 50 mL 无菌离心管中，在 40 mL 完全生长培养基中将细胞稀释至 1-2 个细胞/200 μL 的密度。从起始悬浮液中进行 10 倍系列稀释，以达到此细胞密度。

7.8 将稀释后的细胞铺到 96 孔板中。为了保证能获得敲除细胞，6 孔板一个孔对应至少 2 个 96 孔板。

7.9 3~5 天后，在光学显微镜下观察 96 孔板，对其中含有单细胞的孔进行标记。

7.10 等到孔中的细胞密度达到 70%~90%，用 20 μL 的 1× 胰蛋白酶进行消化。

7.11 加入 200 μL 10% 血清的培养基终止消化。吸取 100 μL 的细胞悬浮液，转移至 1.5 mL EP 管中。剩余的细胞悬浮液留在 96 孔板中继续培养。

7.12 使用 CRISPR/Cas9 genotyping 试剂盒处理收集的细胞，用之前设计的 PCR 引物进行扩增，并将扩增产物进行测序。

7.13 根据测序结果，筛选具有有效突变的单克隆。

8. 单克隆细胞的扩增

8.1 待阳性克隆细胞汇合度达到 70％ 以上时，依次转至 48 孔板，24 孔板，12 孔板，6 孔板中扩大培养。

8.2 记录单克隆细胞的生长情况，评估细胞系的稳定性。

8.3 用目的基因对应蛋白的单抗检测细胞的表达产物，裂解细胞，提取细胞的总蛋白，SDS-PAGE 电泳后转印到 PVDF 膜上，封闭液封闭 1 h 后，用一抗二抗先后孵育，化学发光成像仪下拍照分析。

1. sgRNA 验证：在实验开始前，可以通过 sgRNA 在线验证，筛选高效率的 sgRNA 用于敲除细胞系的构建。

2. 基因拷贝数：建议在开始实验之前确定目标基因的拷贝数。许多永生化细胞系，尤其是癌细胞系，不是二倍体，因此可以具有 3 个或更多的染色体副本。

3. 质粒的质量：使用高质量的无内毒素质粒 DNA 至关重要。通过读取 260 nm 处的吸光度确定 DNA 浓度。通过使用 260 nm/280 nm 的比例（该比例应在 1.8 到 2.0 的范围内）来测量 DNA 纯度。通过琼脂糖凝胶电泳检查质粒的完整性。

4. 细胞状况：使用维护良好并经过常规认证的高质量细胞，包括检测细菌，真菌或支原体污染。如果细胞来自新复苏的细胞，则在使用前至少完成 2 次传代。