免疫组织化学

免疫组织化学 (Immunohistochemistry, IHC) 技术是基于抗原-抗体特异反应的原理，对组织切片中蛋白质和其他抗原进行定性、定位研究。免疫组化按标记物质的种类可分为免疫荧光方法，免疫酶标方法和免疫胶体金技术。其中免疫酶标方法是目前最常用的技术。

免疫酶标方法的基本原理是先和酶标记的抗体与组织作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行研究。目前在病理诊断中广为使用的为过氧化物酶-抗过氧化物酶 (PAP) 法、卵白素-生物素-过氧化物酶复合物 (ABC) 法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接 (SP) 法等。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1.融蜡：72℃ 融蜡 1-2 小时。

2.脱蜡：玻片立即浸入二甲苯 5 分钟 (三次)。

3.水化：无水乙醇 3 分钟 (三次)，95% 乙醇 3 分钟，90% 乙醇 3 分钟，75% 乙醇 3 分钟，蒸馏水 5 分钟。

4.阻断内源性过氧化物酶活性：3% H₂O₂溶液室温孵育切片10 分钟，PBS洗 5 分钟 (三次)。

5.抗原修复：浸没于柠檬酸钠缓冲液，95-100℃ 加热 20 分钟后冷却至室温，TBST 洗 3 分钟 (三次)。

6.封闭：每张切片滴加 100 μL 封闭液室温封闭 20-60 分钟。

7.一抗孵育：甩掉封闭液，每张切片滴加一抗 4℃ 过夜孵育或室温孵育 45 分钟。

8.洗涤：TBST 5 分钟 (四次)。

9.二抗孵育：每张切片滴加二抗，室温孵育 30 分钟。

10.洗涤：TBST 5 分钟 (四次)。

11.染色：滴加 DAB (现配现用) 显色 1 分钟左右 (不可过长)，TBST 终止显色。

12.复染：苏木素复染 30 秒左右 (不可过长，可反复染色)，自来水冲洗 10 分钟。

13.脱水：75% 乙醇 5 分钟，95% 乙醇 5 分钟，无水乙醇 5 分钟 (两次)。

14.封片：使用中性树脂封片，显微镜观察染色结果。

1. 为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好；

2. 组织脱水必须彻底干净；

3. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上;

4. DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深;

5. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在 4℃ 过夜;

6. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。