iPSC细胞分化方法

诱导多能干细胞 (iPS 细胞或 iPSC)，是日本科学家山中伸弥在 2006 年利用病毒载体进行转录因子组合而形成的细胞。iPS 细胞与人类的胚胎干细胞相似，具有自我更新能力和分化全能性。本操作流程为使用合成 mRNA 编码两个原始转录因子 (Atoh1 和 Ngn2) 驱动 iPSC 向多巴胺能神经元的高效分化^[1]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

第 1-3 天：

1. iPSCs 以 1.5×10⁵ 细胞/cm² 的密度铺在预先涂有减少生长因子的基质胶的 12 孔板中。

注：培养基应每天更换，并在 3 天内逐渐从 mTeSR1 转移到 N2。该培养基还包含质量百分比 100 % 的 SHH、质量百分比 100 % 的 FGF8b 和 10 μM 的 DAPT2。

2. 用 A-SA mRNA 转染 iPSCs 3 天，每天更换培养基。(A-SA: mRNA 编码 Atoh1 磷酸位点修饰：331 和 342 位的丝氨酸突变为丙氨酸）。

第 4 天：

3. 用N-SA mRNA转染 iPSCs 1天。(N-SA: mRNA 编码 Ngn2 磷酸化位点修饰：24、193、207、209、219、232、239 和 242 位的丝氨酸突变为丙氨酸。)

第 5 天：

4. 使用细胞消化液分离细胞。

5. 以 1×10⁵ 个细胞/cm² 的密度，在多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板中重新铺上神经元培养基。

注：神经元培养基包含：具有 B27 补充物的神经基础培养基、10 % 的 BDNF、10 % 的 GDNF、1% 的 TGFβ‐3、0.1 mM cAMP、0.2 mM 抗坏血酸和 10 μM DAPT。神经元培养基包含:具有 B27 补充物的神经基础培养基、质量百分比 10% 的 DNF、质量百分比 10% 的 GDNF、质量百分比 1% 的 TGFβ‐3、0.1 mM cAMP、0.2 mM 抗坏血酸和10 μM DAPT。

6. 细胞也可以冷冻保存在含有 40% 神经基础培养基和 B27 补充物、50% 胎牛血清和 10% DMSO 的培养基中。

7. 48 小时后更换培养基以去除未附着的细胞，然后在体外成熟期间每 3-4 天更换一半培养基。

8. 分别使用 MTT 和 LDH 试剂盒进行细胞增殖和细胞死亡分析。

1. 非常轻柔地更换培养基，不要快速添加培养基。

2. 轻轻地左右和前后摇动平板，以确保细胞团均匀分布。