RNA 提取实验方法

不同组织中 RNA 提取的实质就是将细胞裂解，释放出 RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA 等杂质，最终获得高纯度 RNA 产物的过程。目前常用的传统方法是异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法（Trizol），适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材料以及大部分植物材料。Trizol 内含异硫氰酸胍酚和 β-巯基乙醇等蛋白质变性剂，能迅速破碎细胞，且可以有效抑制细胞释放出的 RNA 酶活性。通过溶解蛋白质，使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，释放出蛋白质、DNA、RNA 等物质。结合密度梯度超速离心，使 RNA 沉淀于管底，而 DNA 与蛋白质在上清中^[1][2][3]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

从细菌、血液、动物组织、培养细胞等不同来源的样本中提取高质量的RNA，由于细胞结构和组成的差异，导致前处理方法不同。

• 贴壁细胞

丢弃培养基并用预冷却的 1 x PBS 洗涤 1-2 次。 然后向培养板每 10 cm²区域添加1 mL Trizol，以完全覆盖细胞表面。 用移液器吹打数次，以完全去除细胞。 然后将裂解液转移至 1.5 mL 离心管中，用移液器反复吹混，使裂解充分，冰上放置 5 分钟。

（注：Trizol 的添加量是根据培养板的面积来决定的，而不是根据细胞的数量来决定。如果 Trizol 的添加量不足，可能会导致提取的 RNA 中出现 DNA 污染。）

• 悬浮细胞

离心并收集细胞，用 1 x PBS 洗涤 1-2 次。 每 5 × 10⁶-10⁷ 细胞（约 1 × 10⁸ CFU 细菌）添加 1 mL Trizol，反复混匀，用移液器充分裂解，并在冰上静置 5 分钟。

• 组织样本

用液氮研磨新鲜组织，直至无明显颗粒。每 50-100 mg动物组织中加入 1 mL Trizol，用移液器反复吹打混匀，直至完全裂解。也可以使用均质机进行均质化处理。将裂解液转移至离心管中，4℃ 12000 g 离心 5 分钟，吸去上清液。

• 向上述的裂解液中加入 1/5 Trizol 体积的预冷氯仿，涡旋震荡 15 s，会形成乳浊液，冰上静置 5 min。

• 4°C 12000 g 离心 15 min，此时样品分为三层：上层为无色水相，中层为白色 DNA、蛋白质层，下层为粉红色有机相。RNA 主要存在上层中。

• 小心取出离心管，尽量吸取上层无色水相至一个新的离心管中，大约 600 μL左右，避免吸到中间层。

• 加入等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀，-20°C 静置 10 min。

• 4°C 12000 g 离心 10 min，通常可以看见白色沉淀。小心弃去上清，加入1 mL 预冷的 DEPC 水配制的75% 乙醇，轻弹管底，使沉淀充分洗涤，冰上静置 5 min。

• 4°C 12000 g 离心 5 min，去上清，重复步骤 5 再次洗涤。弃去上清后，在洁净的环境中室温敞口干燥沉淀 5-10 min。

• 加入 20-50 μL RNase-Free dd H2O 或 DEPC 水溶解 RNA，取少量检测，其余可冻存至 -80°C。

• 可通过分光光度计检测 RNA 纯度。RNA 具有连续的吸光谱，在 260 nm 处具有最高吸收峰；蛋白在 280 nm 处有最大吸收峰。如果存在杂质，如乙醇、GTC、GuHCl、EDTA 等，可在 230 nm 处观察。一般情况下，少量的蛋白、盐或基因组等污染是可以接受的。检测得到 RNA 样品的 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比值，可直接反映 RNA 纯度。

• 另外也可以用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。以哺乳动物细胞组织为例，完整的总 RNA可以看到清晰的三条带，分子量从上到下分别是 28 S，18 S，5 S。如果能看见三条带，但是出现条带模糊或弥散，则说明 RNA 有部分降解；如果只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则说明 RNA 已经完全降解。

• RNA 浓度 (ng/μL)= OD₂₆₀稀释倍数 × 40 或者直接使用 NanoDrop 仪器检测。

1. 组织样本保存

• 提取 RNA 时最好使用新鲜的样品，如果不能及时提取 RNA，应立即液氮速冻，再放入 -80°C 低温冷冻保存，避免反复冻融，从而导致提取的 RNA 降解和提取量降低。不建议直接将组织放入 -80°C 冷冻，因为样品冻结缓慢，在这个过程中內源的 RNase 会造成 RNA 降解。

2. RNA 纯度低

• 整个过程要在无 RNase 污染的条件下进行，所有实验所用的枪头、离心管等耗材均要使用 RNase-free 的，所有相关溶液的配制要使用 RNase-free 水或 DEPC 水。实验过程中要戴手套和口罩，且需要经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase 污染，使 RNA 降解，造成 RNA 得率低。

• 加入氯仿时，要剧烈混匀使两相彻底混匀。DNA 在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。吸取上清液时尽量不要分到不同的新的 EP 管中，本身量不多时，尽量集中到一个管中，同时也要避免吸到中间蛋白及有机相，进而降低 RNA 纯度。

• 最终得到的 RNA 沉淀未溶解完全，必要时可以用移液枪轻轻吹打几下。

3. 加入异丙醇看不见沉淀

• 通常情况加入异丙醇后可以看见沉淀，如果没有看到明显的白色沉淀，可能是 RNA 含量低或者样本量过低，可以在 -20°C 放置过夜后再离心。

4. 提取的 RNA 有 DNA 污染

• 氯仿在常温下会与水以一定比例互溶，常温离心会导致上层水相中有少量 DNA 污染，因此加入氯仿后需要低温高速离心。吸取上层液时，也要尽量避免吸到中间层及下层。

• 样品匀浆时添加的试剂量太少。