逆转录聚合酶链式反应

反转录 (reverse transcription, RT-PCR)：反转录技术，简单来说是以 RNA 为模板，合成 DNA 的过程。RT-PCR 是对分子生物学的中心法则的修正和补充^[1]。反转录可以表述为：逆转录和反转录。(1) 反转录是在研究过程中，人为提取 RNA 并以之为模板，在体外合成 DNA。(2) 逆转录是 RNA 病毒的自主行为，以自身遗传物质为模板，在体内合成 DNA。

RT-PCR 具有简单性、特异性、敏感性，可用于检测细胞中基因的表达水平、表达差异；检测 RNA 病毒含量；克隆特定基因的 cDNA 序列。当前已发展实时逆转录聚合酶链式反应，在反转录 PCR 中加入荧光报告分子来监测 PCR 反应每个周期中扩增产物的产生。该方法无需通过凝胶电泳检测扩增产物，具有简单性、特异性、敏感性，以及高通量适配性^[2]。

反转录是以 RNA 为模板，合成 DNA 的过程。 RT-PCR 具有简单性、特异性、敏感性，可用于检测细胞中基因的表达水平、表达差异；检测 RNA 病毒含量；克隆特定基因的 cDNA 序列。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

实验要素：模板 RNA、引物、反转录酶以及其他 (dNTP 及缓冲液)。

实验过程：以 mRNA 为复制模板，经逆转录酶 (I) 的作用，合成与 mRNA 互补的 DNA 链 (即 cDNA)。合成 cDNA 第一条链后，mRNA 被降解，DNA 聚合酶 (II) 继续以 cDNA 第一条链为模板，合成 cDNA 第二条链，由此得到双链 cDNA 分子。

1. 模板 RNA

模板 RNA 的质量决定产物 cDNA 的浓度、纯度、完整度。为避免模板 RNA 的条件限制，应注意如下事项：

（1）获得高纯度、完整度总 RNA。减少盐离子、金属离子、乙醇、苯酚等无机杂质对反转录酶的效率的限制。避免断裂、不完整 RNA 模板影响 cDNA 长度与质量。注：MCE 提供离心柱型 RNA 提取试剂盒 (HY-K1082)。该试剂盒可对病毒 DNA/RNA 抽提，获得产物适用于 PCR、RT-PCR、qPCR、qRT-PCR 等。

（2）增加孵育处理。RNA 的二级结构会引起反转录酶提前终止反应，或从模板脱落。调节温度条件、孵育 RNA，可变性 RNA 二级结构、抑制二级结构形成。

（3）去除基因组 DNA (gDNA)。可加入 DNaseⅠ 预处理 RNA，去除 gDNA。并注意在反转录前灭活内切酶，保证产物 cDNA 的纯度。注：MCE 提供预混 DNA 消化酶的反转录试剂盒 (HY-K0511A)。试剂盒配有 gDNA digester，可消除基因组 DNA 污染，保证产物中 cDNA 的独一性。

2. 引物

反转录过程的引物类型分为三种^[3]：

（1）多聚胸腺嘧啶引物 (Oligo(dT))：可合成全长 cDNA。要求模板 RNA 具有高完整性，并含 Poly(A) 尾、二级结构简单。可应用于构建真核生物 cDNA 文库，克隆全长 cDNA。

（2）随机引物：PCR 产量高，适用范围广。适用原核生物 RNA，rRNA，tRNA，circRNA，microRNA，降解 RNA，以及高 GC 含量和复杂二级结构的 RNA。但特异性差，合成 DNA 片段短。可应用于 circRNA 的反转录，或与 Oligo (dT) 搭配使用。

（3）基因特异引物 (GSP)：特异性强，仅扩增目的片段；要求退火温度较高。可应用于一步 RT-PCR 反应。

3. 反转录酶

反转录酶的发现补充了中心法则，摘得了 1975 年的诺贝尔生理学和医学奖。目前常用的反转录酶主要有两种：一种是来源于禽成髓细胞性白血病病毒 (Avianmyeloblastosisvirus, AMV) 的 AMV 反转录酶，另一种是来源于莫洛尼鼠白血病病毒 (Moloneymurineleukemiavirus, MoMLV) 的 MOMLV 反转录酶。

1. RT-PCR 通常具有一步法或两步法，详见表 2：

2. 以 (HY-K0511A) 试剂盒为例，反应程序如表 3 所示。示例试剂盒配有 4× Super RT Mix，其含有 gDNA digester 抑制剂。

1. 酶制剂要求

（1）gDNA digester Mix 或 Super RT Mix 等含酶预混液，均含有高浓度甘油。使用前应短暂离心收集到反应管底，并用移液枪轻轻吸打混匀后，准确吸取。

（2）所有反应体系应在冰上配制完成。

2. 实验条件

（1）建议使用 RNase-free 枪头和离心管，使用专用器具和无菌水，避免 RNase 污染；

（2）产物可立即用于 qPCR 反应，或在 -20℃ 保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在 -70℃ 保存。cDNA 应避免反复冻融。

1. RNA 纯度和浓度的测定；

2. qRT-PCR 测定及分析。