3X HA Tag 

3X HA Tag is a biological active peptide. (This tag peptide may be used to detect proteins and peptides, and to facilitate functional analysis of proteins of interest.)

1. 从 pMPY-3HA 质粒系列扩增 3X HA 标签^[1]。
pMPY-3xHA 是通过将 NotI 3xHA 片段连接到 pBluescript II SK- 的 NotI 位点构建而成的，形成质粒 pGTEP1。来自 pJJ242 的 SmaI URA3 片段被平端连接到 pBluescript II SK- 的 SmaI 位点，形成了两个方向的载体 pWS8931 和 pWS8932。pWS8931 的 XbaI-EcoRI URA3 片段被连接到切割后的 pGTEPl，以创建 pGTEP1 -URA3。引物 HA-up 5’-ACGATCGTCGAATTCGA GCTCATCTTTTACCCATACGAT-3’ 和 HA-down 5’-TTCGACTGACTCGAGACTAGTAGC GTAATCTGGAACGTC-3’ 用于扩增 3x HA 表位。这一 PCR 片段经 EcoRI 和 XhoI 消化后，与同样限制的 pGTEPl -URA3 载体连接，形成最终产品 pMPY-3xHA。
2. 3xHA 标签可用于融合蛋白的 Western blot 和免疫荧光检测^[2]。
(1) 在第一天，每个 24 孔板的孔中加入总共 1.5 x 10⁴ 的 Hela 细胞。每孔添加 1.5 mL 完全 DMEM 培养基，放入 37℃ 的培养箱中过夜 (o/n)。
(2) 在第二天，去掉每个孔的培养基，换成 0.5 mL 的完全 DMEM 培养基。将 500 ng 的 pCDNA3-VAMP8-3xHA 转染入 Hela 细胞中。在 37℃ 的细胞培养箱中孵育 6 小时。去掉培养基，再换成 1.5 mL 完全 DMEM 培养基。在 37℃ 的细胞培养箱中过夜。
(3) 在第三天，用 1 mL 冰冷 DMEM 培养基洗涤转染的细胞两次。去掉所有培养基。在冰冷的完全 DMEM 培养基中将兔抗 HA 抗体稀释到最终浓度为 1:200。将 150 μL 稀释好的抗 HA 抗体加入每个孔中。在冰上孵育 60 分钟。用 1 mL 冰冷的完全 DMEM 培养基洗三次细胞。用 1 mL 预热的 EBSS (37℃) 洗两次细胞。向每个孔中加入 1 mL 预热的 EBSS，并在 37℃ 的细胞培养箱中孵育 15 分钟、45 分钟和 90 分钟。
(4) 在每个时间点，移除适当的盖玻片，转移到新的 24 孔板中新孔中，加入 1 mL 的 1x PBS。去掉 1x PBS，换成 1 mL 的 4% 多聚甲醛溶液。在室温下孵育 15 分钟。去掉 4% 多聚甲醛溶液，用 1 mL 的 1x PBS 洗三次。每次洗涤在室温下孵育 5 分钟。去掉最后一次洗涤液，置于 1 mL 封闭缓冲液中在室温下封闭 1 小时。将小鼠抗 Lamp1 或小鼠抗 EEA1 稀释至抗体孵育缓冲液中的最终稀释度为 1:100 或 1:1000。去掉封闭缓冲液，换成 100 μL 适当稀释的抗体，在 4℃ 下孵育过夜。去掉稀释的抗体溶液，用 1 mL 的 1x PBS 洗三次。每次洗涤在室温下孵育 5 分钟。稀释与 Alexa 结合的二级抗体。将山羊抗小鼠的 Alexa-488 和山羊抗兔的 Alexa-546 稀释到最终浓度为 1:250 的抗体稀释缓冲液中。去掉洗涤液，加入 200 μL 稀释后的二级抗体溶液，在黑暗中于室温下孵育 1 小时，以减少光漂白。去掉含有二级抗体的溶液，并用 1 mL 的 1x PBS 洗涤三次。每次洗涤时，在室温下孵育 5 分钟。加入 200 μL 含有 1 μg/mL DAPI 的 1x PBS，在室温下孵育 5 分钟。去掉含 DAPI 的溶液，并用 1 mL 的 1x PBS 洗涤两次。每次洗涤时，在室温下孵育 5 分钟。在显微镜载玻片上加 10 μL 的 FluorSave 装载介质。使用镊子从单独的孔中取出盖玻片，并轻轻去除尽可能多的液体。轻轻将盖玻片放在载玻片和装载介质上，确保盖玻片与载玻片之间没有空气泡。去除多余的装载溶液，让载玻片在 4℃ 下固化过夜。在适当的共聚焦或宽场显微镜系统上成像。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

4372.63

C₂₀₅H₂₇₂N₃₈O₆₇S

固体

White to off-white

Met-Glu-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ala-Glu-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ala-Glu-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ala-Lys-Leu-Glu

MEYPYDVPDYAAEYPYDVPDYAAEYPYDVPDYAAKLE

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

Sealed storage, away from moisture and light

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (sealed storage, away from moisture and light)

* 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限：-80°C, 6 months; -20°C, 1 month (sealed storage, away from moisture and light)。-80°C储存时，请在6个月内使用，-20°C储存时，请在1个月内使用。

• [1]. Schneider BL, et al. Use of polymerase chain reaction epitope tagging for protein tagging in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1995 Oct;11(13):1265-74.  [Content Brief]

  [2]. Jean S, et al. VAMP8-3xHA Uptake Assay in HeLa Cells. Bio Protoc. 2016 Feb 20;6(4):e1739.  [Content Brief]

  [3]. Saiz-Baggetto S, et al. Chimeric proteins tagged with specific 3xHA cassettes may present instability and functional problems. PLoS One. 2017 Aug 11;12(8):e0183067.  [Content Brief]