Di-4-ANEPPS 

Di-4-ANEPPS is a voltage-sensitive dye that acts on voltage-gated ion channels (such as sodium channels) and inhibits sodium current, significantly reducing sodium current density, although specific values like IC₅₀ remain unclear. It mainly binds to the voltage-sensitive regions on the cell membrane, changing its fluorescence properties to reflect membrane potential changes and thus affecting the function of ion channels to exert its activity. This substance can be used in cardiovascular research, such as the electrophysiology of cardiomyocytes, myocardial ischemia, and the effects of drugs on cardiomyocytes. It is of great value in evaluating drug cardiotoxicity and exploring the mechanisms of arrhythmias^[1][2].

Di-4-ANEPPS (2 μM；20 min) 处理兔离体心脏时，使心脏电活动发生改变，如心率和心室传导显著减慢，且缺血检测能力下降^[1]。
在对人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞 (hiPSC-CM) 的实验中，Di-4-ANEPPS (6 μM；1 min)，可用于评估 hiPSC-CM 的电生理特性以及检测药物对其电生理的影响^[2]。
Di-4-ANEPPS 适用于不同场景的实验方法如下^[1][2][3]：
1. 兔离体心脏染色实验方法^[1]：
将实验对象随机分为染色组和对照组。
对兔子进行深度麻醉后，进行气管插管和人工通气，随后开胸取出心脏并置于冷的 Krebs-Henseleit (K-H) 溶液中。
将主动脉插管后，把心脏放入充满 K-H 溶液的浴槽中，用混合气体 (95% O₂)和 5% CO₂) 饱和的 K-H 溶液在稳定条件下 (压力 80 mmHg，温度 37°C) 进行灌注，让心脏稳定 20 分钟。
染色组在稳定期后用浓度为 2 μM 的 Di-4-ANEPPS 溶液灌注心脏 20 分钟进行染色，之后再用 K-H 溶液冲洗 20 分钟以洗去未结合的染料分子。
对照组不进行染料加载和冲洗步骤，仅将稳定期延长至 60 分钟。在整个实验过程中，通过置于浴槽中的 Ag-AgCl 圆盘电极的双极导联以非接触方式记录心电图 (EG)，同时定期测量冠状动脉流量以监测心脏制备物的整体稳定性。
实验全程，EG 以 2 kHz 的速率、16 位分辨率进行采样。
2. 人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞 (hiPSC-CM) 染色实验^[2]：
将 hiPSC-CM 保存在液氮中，使用前先进行复苏培养。
细胞被培养在 96 孔玻璃底培养板上，培养板预先用纤连蛋白包被，在湿度适宜的培养箱中 37°C 孵育 3 小时。
在实验前，用无血清培养基 (SF media) 冲洗细胞。
之后，将 hiPSC-CM 用浓度为 6 μM 的 Di-4-ANEPPS 在室温下染色 1 分钟，随后用不含指示剂的 SF media 冲洗细胞，并在培养箱中孵育 2 小时后进行实验。
将培养板置于环境控制培养箱 (37°C，5% CO₂) 中，记录 40 X 物镜下 0.2mm×0.2mm 区域的 Di-4-ANEPPS 的荧光信号 (激发波长为 470±10 nm)。
注：可使用发光二极管 (LED) 作为光源，发射光由两个光电倍增管 (PMTs) 分别在 510-560 nm 和 590-650 nm 处收集。
3. 小鼠脑切片染色实验^[3]：
选用 25-90 天大小的转基因小鼠获取脑切片。
实验时，先对小鼠进行深度异氟醚麻醉，然后断头取脑，将头部浸入冰冷的生理盐水 (人工脑脊液，ACSF，含有 125 mM NaCl、26 mM NaHCO3、2.3 mM KCl、1.26 mM KH2PO4、2 mM CaCl2、1 mM MgSO4 和 10 mM 葡萄糖) 中。
从额叶顶叶皮层切取 300 μm 的冠状切片，先在 37°C 孵育 30 分钟，然后置于室温下。
将急性脑切片转移到直立显微镜上 (10×物镜，0.3 NA)，用充有混合气体 (5% CO₂)/95% O₂) 的生理盐水进行灌注，所有实验测量均在 34°C 进行。
使用刺激隔离单元进行突触刺激，刺激电极 (1.5 mm 硼硅酸盐玻璃带细丝，电阻 ~2MΩ) 用生理盐水回填。
先以 120 ms的刺激间隔 (8.3 Hz) 施加三个突触刺激，1 s 后，再以 12 ms 的刺激间隔 (83 Hz) 施加三个突触刺激。
每个光学实验包含两个突触刺激三联体，持续 3 秒 (3 秒光照暴露)，两个连续的实验扫描之间至少有 12 s 的黑暗 (无光照暴露) 期。
Di-4-ANEPPS 的光源为 LED GYR 500-600 nm，其光学滤光片组包括激发光 520/60 nm、二向色镜 570 nm、发射光 600 LP。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

480.66

C₂₈H₃₆N₂O₃S

90134-00-2

固体

Brown to reddish brown

705

496

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

4°C, protect from light

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)

• [1]. Marina Ronzhina, et al. Di-4-ANEPPS Modulates Electrical Activity and Progress of Myocardial Ischemia in Rabbit Isolated Heart. Front Physiol. 2021 Jun 10;12:667065.  [Content Brief]

  [2]. Hortigon-Vinagre MP, et al. The Use of Ratiometric Fluorescence Measurements of the Voltage Sensitive Dye Di-4-ANEPPS to Examine Action Potential Characteristics and Drug Effects on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Toxicol Sci. 2016 Dec;154(2):320-331.  [Content Brief]