JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit 

线粒体膜电位检测试剂盒 JC-1

ΔΨm 即线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) 的变化是反映线粒体活力的重要参数，可由亲脂性荧光染料 JC-1 检测。线粒体膜电位较高时， JC-1 在基质中汇聚形成聚合物 (J-aggregates)，可以产生红色荧光 (Ex/Em=585/590 nm)；线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体基质中，以单体形式存在产生绿色荧光(Ex/Em=510/527 nm)。线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件。通过红绿色荧光的相对比例变化，可以快速检测线粒体膜电位下降，作为细胞凋亡早期的检测指标。

MCE 线粒体膜电位试剂盒 (JC-1) (JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit) 是一种以 JC-1 为荧光探针，快速检测线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于细胞、组织或纯化的线粒体等样本。

本产品提供了 CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。对于大多数细胞，经 CCCP 处理后，线粒体膜电位会完全丧失，JC-1 染色后观察呈绿色荧光，而正常的细胞经 JC-1 染色后应显示红色荧光。

本产品可以用于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计或流式细胞仪检测，对于 6 孔板检测可检测 100 次。

-20°C，1 年

避光保存，避免反复冻融

短期内使用可于 2-8°C 储存

1. Phosphate-buffered saline (PBS) (1× )的配制

a. 将 PBS (10×) 温浴，直至完全融化。

b. 按 1:10 的比例，用 ddH₂O 稀释 PBS (10×) 至 PBS (1×)。

2. 细胞染色

1). 悬浮细胞

a. 以 6 孔板为例，每孔用 1 mL 培养基重悬 100 万细胞，其他培养器皿以此类推。

b. 阳性对照的设置：取适量 CCCP (50 mM) 恢复至室温，阳性对照孔培养基中加入 1 μL，其终浓度为 50 μM，细胞培养箱 37℃ 孵育 5 分钟。

c. 取适量 JC-1 (200 μM) 恢复至室温，每孔培养基中加入 10 μL JC-1 (200 μM)，其终浓度为 2 μM，细胞培养箱 37℃ 孵育 15-20 分钟。如需对该细胞进行另外的染色操作，则按步骤 3 操作。

d. 37℃ 孵育结束后，400 g 4℃ 离心 3-4 分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

e. 用 PBS (1×) 洗涤 2 次：加入 2 mL PBS (1×) 重悬细胞，400 g 4℃ 离心 3-4 分钟，沉淀细胞，弃上清。重复洗 1 次。

f. 再用 500 μL 的 PBS (1×) 重悬细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计或流式细胞仪分析 (绿色荧光：Ex/Em=510/527 nm；红色荧光：Ex/Em=585/590 nm)。

2). 贴壁细胞

注：若用荧光分光光度计或流式细胞仪检测贴壁细胞，可先对贴壁细胞进行消化、收集，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。若用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测，方法如下：

a. 以 6 孔板为例，每孔加入 1 mL 细胞培养基。

b. 阳性对照的设置：取适量 CCCP (50 mM) 恢复至室温，阳性对照孔培养基中加入 1 μL，其终浓度为 50 μM，轻摇混匀，细胞培养箱 37℃ 孵育 5 分钟。

c. 取适量 JC-1 (200 μM) 恢复至室温，每孔培养基中加入 10 μL JC-1 (200 μM)，其终浓度为 2 μM，轻摇混匀，细胞培养箱 37℃ 孵育 15-20 分钟。如需对该细胞进行另外的染色操作，则按步骤 3 操作。

d. 37℃ 孵育结束后， 吸除上清，用 PBS (1×) 洗涤 2 次。

e. 加入 500 μL PBS (1×) ，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察 (绿色荧光：Ex/Em=510/527 nm；红色荧光：Ex/Em=585/590 nm)。

3. 细胞复染 (以 Annexin V 举例，需自备，本试剂盒不提供)

a. 在步骤 2.c 后，用 PBS (1×) 洗涤 2 次：加入 2 mL PBS (1×) 重悬细胞，400 g 4℃ 离心 3-4 分钟，沉淀细胞，弃上清。重复洗 1 次。

b. 使用 100 μL 的 Annexin V 结合缓冲液 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.4) 重悬经 JC-1 染色的细胞。

c. 加入适量 Annexin V 染色液，细胞培养箱中 37℃ 孵育 15 分钟。

d. 再加入 400 μL 的 Annexin V 结合缓冲液 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.4) 悬浮细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计或流式细胞仪分析。