Vari Fluor 3-colour Multiple Fluorescent Staining Kit (For mouse samples) 

Vari Fluor 三色多重荧光染色试剂盒 （小鼠样本适用）

多重荧光免疫组化技术 (Multiplex immunohistochemical) 也称作酪氨酸信号放大 (TSA, Tyramide dignal amplification) 技术。是一类利用辣根过氧化酶 (HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该方法基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，可以在细胞或组织样本原位上检测多个目标靶点，通过这些靶点的组合和位置关系的研究，进而阐明其相互作用机理。

MCE 提供多种多重荧光检测试剂盒，最高可对六种指标进行同时检测，最大程度满足客户实验需求。

4°C ，1 年

注意避光。

染料配制

染料使用方法：TSA 荧光染料工作液 = VF 荧光染料 + TSA buffer；推荐荧光染料和 TSA buffer 的稀释比为 1：200；稀释比例可以根据具体情况灵活调整优化，最佳范围为 1:50-- 1:400；一般建议若一抗孵育时间常温 1 h-3 h 内，建议稀释比例 1:50 - 1:200,  若一抗孵育时间 4℃ 过夜（12 h 或以上），建议稀释比例 1:200- 1:400 或更高。

实验步骤

样本准备

1）石蜡切片：依次将切片放入二甲苯 Ⅰ 15 min，二甲苯 Ⅱ 15 min-无水乙醇 Ⅰ 5 min-无水乙醇 Ⅱ 5 min-95 % 乙醇 5 min-85 % 乙醇 5 min-75 % 乙醇 5 min，蒸馏水洗。

2）冰冻切片：冰冻切片固定 10-30 min，PBS 洗 5 min，重复3次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透 20min，PBS 洗 5 min，重复3次。

3）细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30 min ，PBS 洗 5 min 重复 3 次，滴加 0.3% triton-X 100 破膜液通透 20 min，PBS 洗 5 min，重复 3 次。

注：

1）组织所包含细胞数应大于 1000 个。

2）切片厚度建议为 4 μm 左右，使用防脱玻片，建议玻片在固定后一周内制备。

3）福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA,封蜡不能有明显的破损。

4）组织应当用10 % 中性福尔马林固定，正常固定时间为 18-24 h。

5）玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。

抗原修复

2.1方式一：柠檬酸修复

1）使用微波炉将载玻片放入 pH 6.0 ，10 mM 柠檬酸钠缓冲液中煮沸。

2）在低火温度下保持 10 min（注意补液）。

3）将载玻片放置在台上，冷却到室温，持续 30 min。

2.2 方式二：EDTA修复

1）使用一个微波炉，并将载玻片放入 1 mM EDTA 中煮沸，pH 8.0。

2）在低火下保持 15 min。无需冷却。

3 阻断内源性过氧化物酶

1）用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 min。

2）切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 min。

3）用 dH₂ O清洗两次，每次 5 min。

4）用 TBST 清洗 5 min。

4 非特异性靶点封闭

1）去除玻片上残存洗液。

2）用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，浸没样本。

3）室温保湿震荡10 min。

5 一抗孵育

1）去除玻片上残留液。

2）用移液枪滴加一抗工作液，浸没样本区域。

3）室温保湿震荡孵育 1 h。

注：孵育时间根据不同抗体进行调整，在湿盒操作避免干燥。

4）用TBST 清洗 3 min，重复一次。

6 HRP 二抗孵育

1) 去除玻片上残留液。

2) 用移液枪滴加 HRP 二抗工作液，浸没样本。

3) 室温震荡孵育 10 min。

4) 用 TBST 清洗 3 min，重复一次。

7 TSA 荧光染料反应液反应

1) 去除玻片上残留液。

2) 用 1×Tyramide Amplification Buffer 以 1 : 200 稀释 TSA 染料，配制成工作液。每个样品准备 100 μL 染色液。

注：染色液在室温下避光保存，最长可保存 24 h。

3）在玻片上滴加 100 uL染色工作液,浸没样本，室温保湿震荡孵育 10 min。

4）在室温下用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 min。

5）微波修复（同上），室温自然冷却。

6) 灭菌水洗片1次，1* TBST buffer浸片 2 min。

7) 染色结束，封片或继续染色（从步骤 2 开始）

注：