Oil Red O 

Oil Red O is a fat-soluble diazol dye, with a maximum absorption at 518 nm. Oil Red O stains neutral lipids and cholesteryl esters but not biological membranes. Oil Red O can be used for detecting and quantifying hepatic steatosis in mouse liver biopsies. Oil Red O staining efficiently helps to visualize the radical changes that occur in tissues as metabolic disease occurs and progresses^[1].

Oil Red O (ORO) 染色脂质体的完整实验步骤^[2]：
1 制备 ORO 储备液
1). 在 250 mL 瓶中加入 500 mg ORO 粉末和 100 mL 100% 异丙醇，充分混合。
2). 配制完成后，将溶液密封保存，避免光照。
2 制备 ORO 工作液
1. 将 ORO 储存液用水稀释至60%异丙醇（体积比为3:2）。
2 使用前，用 0.2 μm 醋酸纤维素无菌注射器过滤器过滤工作液。
注意：为获得最佳溶液质量，建议提前一天配制 ORO 工作液并混合过夜。若需当天使用，需将稀释后的溶液在摇床上混合至少 2 小时。摇动前用石蜡膜包裹离心管以防泄漏。
3 准备样品
1). 在 20°C 条件下，将线虫培养于接种了 OP50 大肠杆菌（对数后期）的线虫生长培养基（NGM）上，直至目标发育阶段。
2). 向培养皿中加入 1 mL PBST溶液（含 0.01% Triton X-100），轻轻摇晃使线虫脱离培养基。倾斜培养皿并用 1 mL PBST 冲洗，将线虫悬液转移至 1.5 mL 离心管。
3). 以 560 × g 离心 1 分钟，弃上清，保留沉淀。重复用 1 mL PBST 洗涤三次，最后弃上清仅保留 100 μL。
4). 向线虫沉淀中加入 600 μL 40% 异丙醇，室温下摇动孵育 3 分钟。
5). 以 560 × g 离心 30 秒，弃上清仅保留 100 μL，注意勿扰动线虫沉淀。
注意：若进行高通量染色，需增加 PBST 体积。线虫在 PBST 中洗涤时间不得超过 15 分钟。若上清中仍有细菌，需额外洗涤。使用摇床或振荡器进行 40% 异丙醇孵育，确保样品充分混匀。
4 染色脂质体
1). 向每份样品中加入 600 μL ORO 工作液，颠倒离心管三次以充分混合线虫与染色液。
2). 室温下以 30 rpm旋转孵育 2 小时。
3). 以 560 × g 离心 1 分钟，弃上清仅保留 100 μL。
4). 用 600 μL PBST 重悬样品，以 30 rpm 旋转孵育 30 分钟以去除多余染色液。
5). 以 560 × g 离心 1 分钟，弃上清仅保留 50 μL。
6). 为更好区分线虫的生殖细胞和肠道细胞核，可在每 1 mL ORO 工作液中加入 1 μL DAPI，染色 2 小时后制片成像。肠道细胞核较大，生殖腺可通过发育中的生殖细胞识别。
注意：ORO 染色后，线虫可能黏附于离心管壁而无法形成明显沉淀。若发生此情况，可再次离心或静置至少 10 分钟使线虫沉降。
5 制片
1). 将线虫沉淀重悬于剩余上清液中，充分混匀。
2). 取 5 μL 线虫悬液滴于载玻片，小心盖上盖玻片以避免气泡。
3). 用指甲油密封盖玻片边缘后进行成像。
注意：固定和染色后的线虫可能僵硬，难以吸取。建议剪去移液器吸头尖端以扩大孔径。若无法立即成像，可将载玻片存放于 4°C 的离心管架中，最长 24 小时。
6 成像
1). 使用具备彩色成像功能的显微镜相机拍摄 ORO 染色线虫。
2). 用 5X 物镜拍摄以涵盖多个线虫视野，切换至 10X 物镜以观察单个线虫细节。
3). 将图像以 TIF 格式导出以避免压缩导致数据丢失。
注意：若使用 ORO+DAPI 染色，需切换至荧光成像模式。
7 结果分析
1). 将图像导入 Image J。若文件格式不被识别，可通过插件菜单中的 Bio-Formats 功能读取。
2). 在图像菜单的“堆栈（Stacks）”功能下，使用“Images-to-Stack”将多张图像合并为堆栈以便比较。
3). 调整“亮度/对比度（Brightness/Contrast）”以增强脂滴可见性。
4). 根据脂质在全身或特定组织的积累情况对图像进行分类。
5). 为评估脂质定位并识别非特异性伪影，可在图像菜单的“颜色（Color）”中选择“Stack to RGB”，分别显示 RGB 通道信号。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

408.49

C₂₆H₂₄N₄O

1320-06-5

固体

Brown to black

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

4°C, protect from light, stored under nitrogen

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light, stored under nitrogen)

* 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限：-80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light, stored under nitrogen)。-80°C储存时，请在6个月内使用，-20°C储存时，请在1个月内使用。

• [1]. Mehlem A, et al. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 2013 Jun;8(6):1149-54.  [Content Brief]

  [2]. Escorcia W, et al. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J Vis Exp. 2018 Mar 5;(133):57352.  [Content Brief]