免疫共沉淀

免疫共沉淀 (Co-immunoprecipitation，Co-IP)：免疫共沉淀技术，是基于抗体和抗原之间的特异性免疫反应，验证蛋白质相互作用的经典方法。Co-IP 的特殊之处在于它能够确定两种蛋白质在完整细胞内的天然结合作用，检测结果可信度高，是构建蛋白质动态网络的强大工具。

技术原理：在非变性条件下裂解完整细胞，从而获得存在于细胞内的蛋白质互作状态。如果在琼脂糖凝珠 (argarose-beads) 上预先固化蛋白 A 的抗体蛋白。加入凝珠后，不仅可以使蛋白 A 免疫沉淀，在细胞内与蛋白 A 结合的蛋白 B 也会一同沉淀下来。经过洗脱，沉淀复合物可以进一步通过 Western blot 检测，确认两种蛋白之间的相互作用，或通过定量/定性分析，得知特定抗原的含量情况^[1]。

发展与应用：随着免疫共沉淀技术的发展，免疫沉淀技术可交联质谱分析技术 (即 IP-MS)，在背景噪声中区分真正的蛋白质-蛋白质相互作用。事实上，在免疫沉淀实验中，常因为非特异性结合物的产生而导致背景噪声。它们包括琼脂糖、琼脂糖或 (亲水性) 聚合物包被的磁珠，或结合在凝珠或融合标签上的蛋白。所以经由凝珠下放“诱饵”捕获的靶蛋白需要经历严格的洗脱条件而确保沉淀物的真实性。但也会因为严格操作，而错过发现与抗体有微弱结合力的蛋白质。如果对沉淀物经过消化处理使其变成多肽，用于质谱分析，就可以通过比较蛋白质的重峰和轻峰之间的比率，区分出真正的蛋白互作复合物^[2]。

免疫共沉淀实验环节复杂，不仅需要高质量抗体，还需要经验丰富的操作技巧。MCE 不仅能够为您提供高品质的免疫沉淀专用试剂，还配有专业的技术支持服务。更多服务信息可进入官网了解：https://www.medchemexpress.cn/

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

Co-IP 实验识别直接或间接的相互作用形成的蛋白质复合物。在这里，我们将以细胞样品为例描述 Co-IP 的过程和常见问题^[3][4][5]。

1. 制胶准备

（1）试剂：10% 的过硫酸铵溶液，1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)，1.0 M Tris-HCl (pH=6.8)，10% SDS，5×电泳缓冲液母液，转膜缓冲液，TBST 缓冲液，封闭液 (4℃ 储存)。

（2）配制蛋白胶：按要求组装仪器并固定，用 1% Agarose 密封玻璃板底部。分别配制蛋白分离胶 (3/4 平玻璃板高度)，蛋白浓缩胶 (平玻璃板高度)。配制体系见附表。

2. 操作过程

（1）试剂预准备：4℃ 预冷 PBS 缓冲液、RIPA 缓冲液、细胞刮子 (用保鲜膜包好后，埋冰下)、离心机。在 RIPA 缓冲液中预先加入蛋白酶抑制剂 PMSF (HY-B0496)；现用现配*)。

*： PMSF 水溶液很不稳定。30 分钟就会降解一半，建议现配现用，尽快使用。

（2）细胞样品的总蛋白提取：转染 24-48 h 后收获细胞，用 PBS 漂洗，重复两次。最后一次弃尽 PBS。在培养瓶中加入 5 倍体积预冷的 RIPA 裂解液 (约 250-350 μL)。反复铺匀裂解液，冰上反应 30 min。使用细胞刮刀刮取细胞，并吸取细胞悬液至 1.5 mL 离心管，继续吹打破碎细胞。4℃，12000 g 离心 30 min，留取细胞裂解液上清。用移液枪将上清转移到一个新的离心管中。

（3）测定蛋白浓度：利用 Bradford 法制定蛋白标准曲线，测定蛋白浓度。测定前将总蛋白至少稀释 10 倍以上，以减少细胞裂解液中去污剂的影响 (分装后，可以在 -20℃ 保存一个月)。用 PBS 将总蛋白稀释到约 1 μg/μL，以降低裂解液中使用去污剂的浓度。如果目标蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应略高于该数值 (如 10 μg/μL)。

（4）准备固相吸附基质：该本文将分别以 Protein A 琼脂糖珠 (HY-K0213) 和 Protein A 磁珠 (HY-K0203) 示例操作*。使用这两种固相基质前，应用 PBS 漂洗，重复两次 (每次 3000 rpm，3 min)。该步骤用于去除非特异性杂蛋白，降低背景噪音。漂洗完成后，Protein A 琼脂糖珠中需再加入 PBS，将其配制成 50% 浓度混悬液。建议减掉枪头尖端，方便吸取 Protein A 琼脂糖珠。

*：琼脂糖珠简单易用，直径大，结合力强，具有多孔易吸附的特点；磁珠的直径小，背景低，抗体消耗少，操作时需借助磁力架。

（5）免疫沉淀：如果使用的是用了交联剂固定有抗体的 Protein A Beads，则按每 1 mL 总蛋白混合 100 μL (50% 浓度) 琼脂糖珠或 10 μL 磁珠的配比，将蛋白提取液加进 Beads 中。4 ℃，水平摇晃混合 10 min。如果使用的是未固定抗体的 Beads，应先加入一定体积的兔抗到 500 μL 总蛋白中，抗体的稀释比例视经验而定。4℃ 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2 h (激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2 h 室温孵育)。最后加入 100 μL Protein A 琼脂糖珠下拉抗原抗体复合物。4℃ 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜 (或室温 1 h)。如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2 μL “过渡抗体” (兔抗鼠 IgG 或兔抗鸡 IgG)。

（6）收集沉淀复合物：a. 收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物。3000 rpm 离心 3 min，4℃，将琼脂糖珠离心至管底，小心吸去上清液。b. 收集磁珠-抗原抗体复合物。4℃ 条件下，使用磁力架吸附磁珠至管底，使用移液枪吸除提取液。在沉淀复合物中重新加入 800 μL 预冷的 RIPA 缓冲液*洗涤，重复 3 次。最后加入 60 μL 的 2x SDS-PAGE 上样缓冲液，轻柔混匀，重悬 Beads-抗原抗体复合物。缓冲液的量可按上样需要而定，60 μL 体系足够上样三次。

*：该步骤的 RIPA 缓冲液使用范围有局限，可能会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合。视情况可换为 PBS 缓冲液洗涤。

（7）免疫分析的预处理：将上样样品 99 ℃ 水浴 5 min (各样品管加上防爆夹)，以游离抗原，抗体，珠子。水浴结束后立即放置在冰上备用。离心，收集上清电泳 (可暂冻于 -20℃)，并收集剩余 Protein A 琼脂糖珠。电泳前上清液应复煮 5 min 变性。

3. 通过免疫共沉淀确定结合蛋白

（1）将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜；

（2）通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；

（3）从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1 mL 50% 乙腈洗两次，每次 3 min；

（4）用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再用电洗脱分离肽；

（5）通过窄孔高效液相色谱分离肽。用多肽仪 ABI 477A 或 ABI 494A 上进行收集肽的 Edman 降解测序。

1. 实验样品冲洗：所有实验操作建议在超净工作台内进行，如无条件应在整洁的工作台上进行。漂洗细胞环节，需注意低温条件会导致半贴壁细胞或温度敏感细胞更容易脱落，造成样品损失。

2. 裂解细胞：应用温和的条件裂解细胞，保证细胞内所有蛋白质-蛋白质的相互作用得到完整保留；一般使用非离子变性剂，如 Triton X-100 (HY-Y1883A)；每种细胞的裂解条件不一样，应通过经验确定；杜绝使用高浓度的变性剂 (0.2% SDS)；细胞裂解液中不要漏加酶抑制剂。

3. 抗体选择：使用来源明确的抗体；可以共同使用多种抗体。常用的对照抗体，如单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗；兔多克隆抗体：正常兔 IgG。

4. 避免背景污染：需要区分特异性沉淀蛋白和外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。可设置对照组，获取不表达抗原的细胞溶解物中的沉淀复合物与实验组比较，选择蛋白峰值特异的产物。

5. 实验背景：进行亚细胞定位，确定蛋白-蛋白的相互作用场所。CO-IP 实验适用于发生在细胞中的互作验证，不适用因为细胞溶解而产生的互作现象。

6. 制胶细节：配制蛋白分离胶，加样顺序从上至下。加样完毕后迅速混匀并使用 5 mL 移液枪将液体灌注到两层玻璃板之间。应匀速灌注以避免气泡产生，灌注至平玻璃板 3/4 时停止。灌注分离胶结束后 30-60 s 内灌注 ddH₂O 至玻璃板边缘，静置 30 min 至分离胶与水层出现明显界限。使用吸水纸吸尽残余液体。配置蛋白浓缩胶，加样顺序从上至下，加样完毕后迅速混匀并使用 5 mL 移液枪将液体灌注到两层玻璃板之间，应匀速灌注以避免气泡产生，灌注至平玻璃板顶端时停止。加样完毕后立即插入模具梳子，待完全凝固后方可使用 (约 30 min)。