人胰岛细胞培养

胰岛细胞培养是体外保存胰岛的方法之一，且可使胰岛纯化、免疫原性降低。胰岛细胞培养需要解决一些特殊问题: 首先由于胰岛细胞团体积较大，胰岛中心氧供不足可能发生坏死;其次胰岛培养与其他细胞培养技术的评估和比较不同；同时不同物种的胰岛培养技术和生物学行为不同。胰岛移植应避免污染，尽管胰岛污染与冷冻保存的胰岛有关，但胰岛移植前增加的任何步骤均可能增加胰岛污染的可能性。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

• 自动分离人胰岛

1. 将胰腺从已故供体上取出时，置于 4°C Eurocollins 溶液中。

2. 用 18 号导管插管胰管，经胰管注入含有 2% 胎牛血清和 2 mg/ml 胶原酶的 Hanks 平衡盐溶液。在 28-30℃ 时，胶原酶溶液的注射量约等于胰腺重量的两倍。

3. 将胰腺放置在由两个不锈钢腔组成的分离器中，在低腔中加入额外的胶原酶溶液 (2 mg/ml) 并关闭设备。

4. 启动激振器 (320 次振荡/分钟)，打开流速为 40 ml/min的蠕动泵。当消化室温度达到 37℃ 时，接通和关闭加热电路旁路，保持消化室温度稳定。将冷却回路和再循环筒置于冰浴 (4°C) 中。

• 胰岛细胞纯化

1. 从胰岛制剂中取 3 ml 的组织颗粒，装入 250 ml 的塑料注射器中。向每个注射器中泵入 100 ml 密度为 1.074 g/cm³ 的 Ficoll 梯度液。

2. 将等分液悬浮在 10 ml Hanks 溶液中，加入 40 ml Ficoll 梯度液 (密度= 1.058 g/cm³)，并在 1.074 g/cm³ 梯度液上分层。

3. 将注射器在 4°C 下以 800 g 离心 16 分钟。丢弃含有细胞和碎片的顶层溶液 (20-30 ml)。

4. 在下层的 50-80 ml 梯度溶液中存在纯化的胰岛。腺泡组织在注射器底部呈颗粒状。如果分离的最佳状况出现，腺泡颗粒里应该只有几个胰岛。

5. 950 g 离心 Hanks 液 5 分钟，在 4°C 下洗涤含有纯化胰岛的溶液层。将胰岛微丸混合，悬浮于 200 ml 含有 10% 胎血清、青霉素 (100 U/ml)、硫酸链霉素 (100 μg/ml)、D -葡萄糖 (1 mg/ml)、L -谷氨酰胺 (2 mM) 和 HEPES (25 mM) 的组织培养基 (CMRL-1066) 中。用 NaOH 调节培养基至 pH 7.4。

6. 取 0.5 ml 等分液，用配备绿色滤镜的相显微镜测定总胰岛数、胰岛质量和制剂纯度。

• 体外检测胰岛功能

1. 在未经处理的 t 型瓶中培养胰岛并过夜，设置温度为 37°C。每 50 ml 的 CMRL-1066 含有 6000 个胰岛。

2. 腔室包含一个醋酸纤维素微孔过滤器。37°C 下用克雷布斯-林格碳酸氢盐溶液 (0.5% 白蛋白，95% O₂/5% CO₂)对胰岛进行循环。

3. 用浓度为 60 mg/ml、300 mg/ml 和 600 mg/ml 葡萄糖对胰岛灌注 40 分钟。流速为 1ml /min，用自动分馏收集器收集灌注液。 冷冻样品以备后续胰岛素检测。

• 胰岛细胞培养

1. HTB-9 膀胱癌细胞株在含有 10% FBS 和 1 倍青霉素-链霉素的 RPMI-1640 的培养液中培养。

2. 胰岛培养液配制： CMRL-1066 + 10% FBS + 1 倍青霉素-链霉素 + 2 mM L-谷氨酰胺。

3. 将 HTB-9 细胞在 T-175 培养瓶中培养至 100% 融合，换液后继续培养 3 天。

4. 收集 HTB-9 上清液，用 0.22 μm 滤膜过滤，在 -20℃ 下保存至使用。

5. 接种胰岛细胞的前一天，在 384 孔板 的每孔涂 10 μl 的 HTB-9 上清液，在 37℃，5% 二氧化碳中培养过夜。

6. 每个孔用 50 μl PBS 清洗 2 次。

7. 加入 10 μl 胰岛培养液，放回培养箱。

8. 将胰岛组织用 50 ml 的离心管离心，并用 PBS 清洗一次。

9. 在 5% 二氧化碳，37℃ 的培养箱中，用 Acutase (5000I EQ/mL) 解离胰岛组织 20min，使细胞团块下降至 10 个细胞。在 10 分钟时，搅拌离心管并放回培养箱。

10. 移液管轻柔吹吸 5-7 次。

11. 加入 CMRL 培养基终止消化反应 (每 1 ml Acutase 对应 9 ml 培养基)。

12. 将胰岛细胞以 250,000 /ml 的密度悬浮于配制好的胰岛培养液中。

13. 将胰岛细胞以 10,000 个细胞/孔分到有涂层的 384 孔培养板中，37℃，5% CO2，培养。

14. 经过 14 天 HTB-9 细胞系基质上的培养，一般会有超过 100 倍的增殖。

1. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

2. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。