质粒构建方法

PCR 仪；电泳仪；凝胶成像仪；超净台；离心机；测序仪或测序公司

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达^[1]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. 根据所用 PCR 试剂的说明书对插入基因片段进行 PCR 扩增并与引物序列连接，引物包含与质粒酶切位点和目的基因重叠的序列。

2. 根据所用限制性内切酶的说明书酶切 线性化质粒骨架。

3. 根据所用碱性磷酸酶的说明书处理线性化质粒骨架。

4. 在琼脂糖凝胶中运行 PCR 产物和线性化骨架以确认大小。

5. 根据所用凝胶回收试剂盒说明书从凝胶中回收纯化 DNA。

6. 根据所用 T4 连接酶说明书连接线性化的质粒骨架和插入基因片段。

7. 根据所用感受态细胞的说明书，以连接产物转化感受态细胞。

8. 进行菌落 PCR 并电泳，筛选成功插入基因的克隆。

9. 测序以验证插入的基因是否正确。

1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%～60% 范围之内时，克隆效率将达到最大。

2. 最适质粒骨架与插入片段摩尔比为 1:2。

3. 同一酶切体系中最好使用同一家公司的酶。