Pull-down 实验方法

Pull-down 实验是一种体外技术，用于检测两种或多种蛋白质之间的物理相互作用，是确认预测的蛋白质-蛋白质相互作用或识别新的相互作用伙伴的宝贵工具。该方法通常涉及使用亲和纯化以及各种洗涤和洗脱步骤。
Pull-down 实验使用纯化和标记的蛋白质作为“诱饵”来结合任何相互作用的蛋白质。该方法包括首先将标记的蛋白质（诱饵）固定在标签特异的亲和配体上，创建亲和支持物以捕获和纯化与诱饵相互作用的其他蛋白质（猎物）。诱饵和猎物蛋白可以从多种来源获得，例如细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统和体外转录/翻译系统。一旦猎物蛋白与固定化诱饵蛋白一起孵育，根据亲和配体，使用洗脱缓冲液洗脱相互作用的复合物。Pull-down 实验后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 解析蛋白质组分，然后通过凝胶染色或蛋白质印迹检测可视化。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. 材料

1.1 细胞裂解液的制备

在室温下用蒸馏水制备所有溶液并将其保持在指定温度。

真核细胞；

含有与特定标签融合的目标基因的质粒；

转染试剂；

1×PBS；

RIPA 缓冲液；

抗蛋白酶混合物：混合 1% (v/v) 的蛋白酶抑制剂混合物 (HY-K0010) 、磷酸酶抑制剂混合物 2 (HY-K0022)、磷酸酶抑制剂混合物 3 (HY-K0023) 和 PMSF (HY-B0496)。

1.2 拉下实验

1.2.1. 1 M Tris-HCl，pH 7.5溶液。称重121.1 g Tris碱并转移至 1 L 量筒中。加水至 800 mL，混匀，用 HCl 调节 pH，用水定容至 1 L。室温保存。

1.2.2. 5 M 氯化钠储备溶液。称取 292.2 g NaCl 并转移至 1 L 量筒中。加水至 800 mL，搅拌，用水定容至 1 L。

1.2.3.平衡缓冲液：20 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM NaCl。将1 mL 1 M Tris-HCl，pH 7.5溶液与2.5 mL 5 M NaCl溶液在 50 mL 离心管中混合，并加水至50 mL体积。储存于 4℃保存。

1.2.4.洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM NaCl，500 mM Imidazole。称取 1.7 g Imidazole溶解到50 mL平衡缓冲液中。储存于 4℃。

1.2.5.纯化的 His-标签蛋白（诱饵）。

1.2.6. Ni-NTA 琼脂糖珠：6% 珠状琼脂糖（交联），预装 Ni²⁺（Protino^® Ni-NTA 琼脂糖）。储存于 4℃。

1.2.7.用于重力流的 0.8 mL 空柱（Pierce^™ 离心柱）。

1.2.8.微量冷冻离心机。

2. 方法

2.1 细胞裂解液的制备

2.1.1.将真核细胞以 5x10⁵ 接种到 10 cm 细胞培养皿中，并在 4℃ 的 CO₂ 中孵育过夜。

2.1.2.用含有与特定标签融合的目标基因的质粒转染细胞，并用适当的转染试剂持续最佳表达蛋白质所需的时间（通常 16-24 小时）。

2.1.3.将板置于冰上冷却细胞，用 1×PBS 洗涤细胞。添加 2 mL 冷 PBS，并使用细胞刮刀收获细胞。

2.1.4.在 4℃ 下以 80×g 离心 5 分钟。

2.1.5.用含有抗蛋白酶混合物的 200 μL RIPA 缓冲液重悬细胞。

2.1.6.在冰上孵育 20 分钟，并每 5 分钟用 P200 微量移液器轻轻混合一次。

2.1.7.在 -80℃ 下储存细胞。

2.1.8.在拉下实验之前，解冻制备的细胞提取物。在 4℃ 下以 17,000×g 离心 20 分钟。 按照小标题 2.2 中的步骤 9 使用上清液作为猎物。

2.2 Pull-Down 实验

2.2.1.将 120 μL Ni-NTA 琼脂糖珠转移至重力流柱。

2.2.2.在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟。丢弃流过液。

2.2.3.向柱中加入 400 μL 蒸馏水。

2.2.4.在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟。丢弃流过液。

2.2.5.将 50 μg His 标记蛋白（诱饵）与 400 μL 平衡缓冲液小心混合，然后加载到柱上。

2.2.6.在 4℃ 下搅拌孵育 1 小时，在冰上不搅拌孵育 10 分钟。

2.2.7.在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟，并保持流通。

2.2.8.将流过液加载到柱中，并在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟。将流通液保持在 4℃ 进行分析。

2.2.9.将 200 μL 细胞提取物与 200 μL 平衡缓冲液混合并加载到柱上。

2.2.10.在 4℃ 下搅拌孵育 1 小时，然后在冰上不搅拌孵育 10 分钟。

2.2.11.在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟。保持流通以进行分析。

2.2.12.向柱中添加 400 μL 平衡缓冲液来清洗柱。

2.2.13.在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟。丢弃流过液。

2.2.14.向柱中添加 400 μL 含有 50 mM Imidazole 的平衡缓冲液来清洗柱。 保留第一次洗涤以供分析。

2.2.15.在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟。丢弃流过物。

2.2.16.重复步骤 14 和 15 三次，然后转至步骤 17。将最后的洗涤级分保持在 4℃ 下进行分析。

2.2.17.通过将 80 μL 洗脱缓冲液加载到柱中并在 4℃ 下孵育 10 分钟来进行洗脱。

2.2.18.在 4℃ 下以 1000×g 离心柱 1 分钟并保留洗脱分数。

2.2.19.对洗脱分数重复步骤 17 和 18。将洗脱部分保持在 4℃ 进行分析。

3. SDS-PAGE 和蛋白质组分分析

3.1.向 15 μL 蛋白质组分中添加 5 μL Laemmli 裂解缓冲液，4倍浓缩。在 100℃ 下加热 3 分钟，然后使用微量离心机离心 30 秒以减少冷凝物。

3.2.将 10 μL 蛋白级分和 5 μL 蛋白梯上样到 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。

3.3.在运行缓冲液中以 100 V 电泳 15 分钟，然后以 180 V 电泳，直至染料前沿到达凝胶底部。

3.4.通过免疫检测或考马斯蓝染色鉴定相互作用的蛋白质。

1. 溶液存放 6 个月后最好不要使用。

2.特定蛋白质-蛋白质相互作用可能需要不同的缓冲液，例如 HEPES、MES 或磷酸盐缓冲液。此外，可以测试不同的 pH 值，因为这些值是特定的并且取决于蛋白质之间的相互作用。

3. Pull-down 实验使用新鲜的平衡和洗脱缓冲液效果更好。

4.在 -20℃ 储存之前，制备 1 mL 等分试样。这将防止反复解冻引起的降解。

5.在 -20℃ 储存之前，制备 500 μL 等分试样。使用过的 Laemmli 裂解缓冲液可在 4℃ 保存 1 个月。

6.作为阴性对照，制备不表达诱饵蛋白的细胞裂解物（阴性细胞裂解物）。这将消除因细胞裂解物蛋白与 Ni-NTA 琼脂糖珠的非特异性相互作用而产生的假阳性。

7.全细胞裂解液代替上清液部分也可用于测试目标猎物蛋白是否定位在沉淀部分中。

8.尽量在冰上或 4℃ 下工作，以防止蛋白质降解或变性。

9.根据诱饵和猎物蛋白质之间相互作用的强度，在 4℃ 下搅拌的孵育时间可以从几个小时延长到过夜。