Vari Fluor 565 SE  (Synonyms: VF 565 SE)

Vari Fluor 565 SE (VF 565 SE) is a dye marker of the Vari Fluor SE series (Ex/Em=563 nm/594 nm). The Vari Fluor SE series of dyes are a class of fluorescent dyes containing NHS ester groups used to label free amines (-NHX) on antibodies, proteins, peptides, amine-modified oligonucleotides and other biomolecules.

原液制备
1.蛋白准备
为了获得最佳标记效果，请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。
1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。
2.染料准备
将无水 DMSO 稀释 VF 染料，制成 10 mg/mL 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。
注：VF 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
3.染料工作液用量计算
标记反应所需的 VF 染料用量取决于要标记蛋白的用量，VF 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
例：假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000)，用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg VF 染料，则所需 VF 体积为 3.95 μL，详细计算流程如下（以 VF 488 为例）：
1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG)×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10^-6 mmol
2) mmol (VF 488) = mmol (IgG)×10 =6.7×10^-6 mmol×10 = 6.7×10^-5 mmol
3) μL (VF 488) = mmol (VF 488)×MW (VF 488) / mg/μL (VF 488) = 6.7×10^-5 mmol× 834 mg/mmol / 0.01 mg/μL = 5.6 μL (VF 488)

使用方法
1.标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL VF 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品
溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。 2) 将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟，每隔 10-15 分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。
2. 蛋白纯化脱盐
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1)按照生产说明书制备 Sephadex G-25 柱。
2)将反应混合物装入 Sephadex G-25 色谱柱顶部。
3)当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4)向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4)，完成柱纯化。结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。

保存条件
-20℃ 避光保存

注意事项
1.VF 染料对光及湿度敏感。即用即配 VF 溶液并丢弃未使用的部分。
2.低浓度的叠氮化钠 (≤3 mM 或 0.02％) 或硫柳汞 (≤0.02 mM 或 0.01％) 不会显著干扰蛋白标记；但是 20-50％ 的甘油会降低标记效率。
3.避免使用含伯胺 (例如 Tris，甘氨酸) 或铵离子的缓冲液，它们与待标记蛋白会发生竞争反应降低标记效率。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

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• [1]. Nanda JS, et al. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods Enzymol. 2014;536:87-94.  [Content Brief]