HA Peptide 

HA Peptide (HA tag) is a nine amino acids peptide derived from the human influenza hemagglutinin (HA). HA Peptide is extensively used to isolate, purify, detect, and track the protein of interest in cell biology and biochemistry.

一、HA 标签化的 Hop 蛋白检测^[3]
1. 细胞转染与蛋白质表达
(1) 选择 HEK293T 细胞，培养在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中。
(2) 通过转染，使用 pcDNA3.1-HOP wt-HA 载体将编码 HA 标签的 Hop 蛋白基因转染入 HEK293T 细胞。对照组使用不含目标基因的载体。
(3) 转染后 48 小时，用 PBS 洗涤细胞，收集细胞进行裂解。
2. 细胞裂解与蛋白提取
(1) 将裂解缓冲液（含 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 250 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 1% IGEPAL, 1 mM DTT 及蛋白酶抑制剂）加入到收集的细胞中，室温下孵育 10 分钟。
(2) 通过离心 (16,100 g, 10 分钟) 分离细胞裂解液，去除细胞沉淀。
(3) 收集上清液，测定蛋白浓度并准备样品。
3. 蛋白质分离
(1) 将蛋白样品分为不同稀释比例 (如 1:2 和 1:10)，根据蛋白浓度，取 30 μg 样品加载至 10% SDS-PAGE 凝胶中进行电泳。
(2) 电泳结束后，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
4. 蛋白免疫印迹（Western Blot）
(1) 将转膜后的硝酸纤维素膜在封闭液中 (含 5% 非脂奶粉, TBS, 0.2% Tween 20 或 IGEPAL) 封闭 30 分钟。
(2) 将膜与目标抗体 (如 AF291 或 AE391 抗 HA 抗体，稀释度 1:1000) 在 TBS 缓冲液中孵育 1 小时。
(3) 使用抗 GAPDH 抗体作为载入对照 (稀释度 1:5000)，同时孵育。
(4) 洗涤膜 3 次，每次 15 分钟，使用含 0.2% Tween 20 或 IGEPAL 的 TBS 洗涤。
(5) 将膜与 HRP 标记的二抗孵育 1 小时，稀释度为 1:10,000。
(6) 再次洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。
(7) 使用 ECL 显色试剂进行蛋白显色，通过成像系统捕捉信号。
5. 结果分析
(1) 对实验结果进行分析，检查 HA 标签蛋白的信号强度。
(2) 注意 AF291 和 AE391 抗体可能会识别多个与目标蛋白无关的内源性蛋白，因此需与对照抗体 (如 HA.11 抗体) 对比结果，以确保结果的特异性。

二、通过 HA Peptide 构建大肠杆菌中 T7 启动子驱动的 HtrA1 基因表达系统^[4]
(1) pHA-M-HtrA1 质粒构建：
(a) 使用 EcoRI 和 XhoI 酶切 pcDNA3-HA 和 pBS-M-HtrA1 质粒，从而使 HtrA1 的 N 端与 HA tag 融合。
(b) 以 pHA-M-HtrA1 质粒为模板，使用特定的引物对 (Forward primer: ATCGATATGTACCCTTACGATGTACCG; Reverse primer: CTCGAGCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTA) 进行 PCR 扩增，得到 M-HtrA1 cDNA 片段。扩增出的 M-HtrA1 cDNA 片段同样用 EcoRI 和 XhoI 酶切。
(c) 将酶切后的 M-HtrA1 cDNA 片段插入 pcDNA3.0 质粒中，完成构建。
(2) 大肠杆菌活性检测
将 pHA-M-HtrA1 质粒转染入大肠杆菌 TOP10 细胞，大肠杆菌 TOP10 细胞接种于含有 50 μg/ml Ampicillin (HY-B0522) 的 Luria-Bertani 培养基 (LB-Amp)，并在 37 ℃ 下培养。通过监测 OD600 值来检测生长情况。
(3) 通过免疫印迹分析 (IB) 测定 HtrA1 表达
(a) N 端融合有 HA 标签的 HtrA1 基因可通过 IB 检测到。
(b) N 端融合有 HA 标签的 Parkin 蛋白在大肠杆菌载体中表达量上升。
总结：通过构建 HA Peptide 标记的大肠杆菌基因表达系统，来快速检测靶基因表达和大肠杆菌细胞活性的影响，从而用作哺乳动物细胞实验的预测试工具。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

1102.15

C₅₃H₆₇N₉O₁₇

92000-76-5

固体

White to off-white

Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala

YPYDVPDYA

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

Sealed storage, away from moisture

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (sealed storage, away from moisture)

* 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限：-80°C, 6 months; -20°C, 1 month (sealed storage, away from moisture)。-80°C储存时，请在6个月内使用，-20°C储存时，请在1个月内使用。

* 备注：如您选择水作为储备液，请稀释至工作液后，再用 0.22 μm 的滤膜过滤除菌后使用。

• [1]. Zhao X, et al. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013;2013:581093.  [Content Brief]

  [2]. Schembri L, et al. The HA tag is cleaved and loses immunoreactivity during apoptosis. Nat Methods. 2007 Feb;4(2):107-8.  [Content Brief]

  [3]. Keszei Z, et al. AF291 and AE391 single-chain antibodies recognize the HA tag by Western blotting[J]. Antibody Reports, 2019: e25-e25.

  [4]. Moon JM, et al. A new idea for simple and rapid monitoring of gene expression: requirement of nucleotide sequences encoding an N-terminal HA tag in the T7 promoter-driven expression in E. coli. Biotechnol Lett. 2012 Oct;34(10):1841-6.  [Content Brief]