EN219-alkyne 

EN219-alkyne is an alkyne-functionalized EN219 probe. EN219 (HY-P0287A) is a moderately selective synthetic covalent ligand against an N-terminal cysteine (C8) of RNF114 with an IC₅₀ of 470 nM. EN219 inhibits RNF114-mediated autoubiquitination and p21 ubiquitination^[1][2]. EN219-alkyne is a click chemistry reagent, it contains an Alkyne group and can undergo copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAc) with molecules containing Azide groups.

EN219-alkyne 探针原位标记和下拉研究 (以 231MFP 细胞为例)^[1]
1.用 DMSO 载体或 50 μM EN219-alkyne 探针处理 231MFP 细胞 90 分钟。
2.将细胞收集在 PBS 中并通过超声处理裂解。
3.制备蛋白质印迹样品：将裂解物 (500 μL 中的 1 mg 蛋白质) 等分到每个样品中，然后按序添加：10 μL 5 mM 生物素吡啶甲酰叠氮化物，50 μL 点击反应混合物 (即三份 TBTA 5 mM TBTA 的丁醇，它包括一份 DMSO (4:1，v/v)、一份 50 mM Cu(II)SO4 溶液，和一份 50 mM TCEP)。
4.温和搅拌样品，在室温下孵育 1 小时。
5.在 CuAAC 之后，通过以 6,500 g 离心沉淀蛋白质，并在预冷的甲醇 (500 μL) 中洗涤两次。
6.样品在预冷 4℃ 离心机中以 6,500 g 离心 4 分钟，吸出过量甲醇，随后通过探针超声在含有 1.2% SDS 的 250 μL PBS 中重组蛋白质沉淀。
7.将蛋白质组在 90℃ 下变性 5 分钟，通过 6,500g 离心沉淀不溶性成分，并将可溶性蛋白质组稀释在 1.2 mL PBS 中 (样品中 SDS 的最终浓度为 0.2%) 至总体积为 1450 μL，保留 50 μL 作为输入。
8.将 85 μL 预洗过的 50% 链霉亲和素琼脂糖珠浆添加到每个样品中，并在室温下轻轻搅拌样品孵育过夜。
9.在室温下以 6,500 g 旋转珠子 2 分钟后，从每个样品中吸出上清液。
10.将珠子转移到旋转柱上并用 PBS 洗涤 3 次。为了洗脱，将珠子在 50 μL LDS 样品缓冲液中煮沸 5 分钟。离心后收集洗脱液并通过免疫印迹分析。

En219 (1 μM; 90 min) 与 RNF114 C8、TUBB1 C201、HSPD1 C442 和 HIST1H3A C97 相互作用，通过同位素串联正交蛋白水解 (isoTOP-ABPP) 分析证实^[2]。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

488.76

C₂₂H₁₉BrClN₃O₃

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• [1]. Luo M, et al. Chemoproteomics-enabled discovery of covalent RNF114-based degraders that mimic natural product function. Cell Chem Biol. 2021 Apr 15;28(4):559-566.e15.  [Content Brief]