细胞凋亡检测方法

细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，其形态学特征区别于正常细胞。细胞凋亡的早期伴随着细胞皱缩和固缩，并且细胞体积更小，细胞质致密，细胞器排列更紧密。另外，细胞凋亡不同于坏死。细胞坏死伴随着细胞肿胀、细胞器和细胞膜破裂、细胞质释放和炎性细胞的募集。而细胞凋亡则导致细胞死亡，细胞收缩，细胞膜保持完整，细胞质保留在凋亡小体中，且没有炎症。
细胞凋亡途径主要存在三种：外在 (死亡受体介导) 途径、内在 (线粒体) 途径和穿孔素/颗粒酶途径。具体而言，外在途径通过死亡受体介导的相互作用启动细胞凋亡，并激活 caspase-8。内在途径通过非受体介导的刺激启动细胞凋亡，例如辐射、毒素、缺氧、过热、病毒感染和自由基。内在途径会引发细胞内线粒体引发的事件 (如线粒体跨膜电位的丧失)，并激活 caspase-9。在穿孔素/颗粒酶途径中，涉及 T 细胞介导的细胞毒性，并可通过颗粒酶 B 或颗粒酶 A 诱导细胞凋亡。颗粒酶 B 可激活 caspase-10 或直接激活 caspase-3，但颗粒酶 A 以不依赖 caspase 的方式起作用。值得注意的是，这三种途径最终都会引发 caspase-3 的裂解启动。caspase-3 的激活会导致 DNA 片段化、细胞骨架和核蛋白降解、蛋白质交联、凋亡小体的形成、吞噬细胞受体配体的表达^[1]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1. 基于细胞形态学改变的 TEM 检测

透射电子显微镜 (TEM) 仍被认为是检测细胞凋亡的金标准。细胞凋亡的主要特征是：(1) 电子致密核 (早期边缘化); (2) 核碎裂; (3) 完整的细胞膜; (4) 杂乱无章的细胞质、细胞器； (5) 大而透明的空泡; (6) 细胞表面有气泡。透射电镜的主要缺点是成本高，一次只能检测一小块区域，难以及早发现凋亡细胞^[1][2]。

2. Annexin V 染色

Annexin V 属于钙-依赖性磷脂结合蛋白，可特异性粘附细胞膜上的磷脂酰丝氨酸 (PS)。在健康细胞中，PS 位于质膜的胞质侧。但 PS 可在细胞凋亡早期转移至细胞膜的细胞外小叶。因此，荧光标记的 Annexin V (如 FITC、EGFP 标记的 Annexin V) 可用于检测细胞凋亡早期细胞膜胞外侧 PS 的存在。由于 PI 具有高 DNA 亲和力，因此只能在受损细胞中有效结合 DNA，并被完整细胞排除在外。另外，碘化丙啶 (PI) 可用于检测坏死细胞。在大多数情况下，PI 可与 Annexin V 结合以区分凋亡细胞和坏死细胞。Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 (HY-K1073) 和Annexin V-EGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒 (HY-K1074) 是常见的凋亡检测试剂盒^[3]。

Annexin V/PI 染色可参考如下方案^[4]。

1. 对于悬浮细胞: 1000 g 离心 5 分钟，弃上清。加入 1 mL 预冷的 PBS 重悬细胞，1000 g 离心 5 分钟，弃上清。

2. 将细胞重新悬浮于 200 μL binding-buffer中。

3. 加入 10 μL DAPI、10 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，置于4 ℃ 暗室中孵育 30 分钟。

4. 立即在共聚焦激光扫描显微镜下观察 Annexin V-FITC 和 PI 的荧光。波长如下：Annexin V-FITC (Ex = 488 nm; Em = 525 nm，绿色荧光), PI (Ex = 550 nm; Em = 617 nm，红色荧光)。活细胞呈现为 Annexin V/PI 阴性，早期凋亡细胞为 Annexin V⁺/PI⁻，而晚期凋亡细胞为 Annexin V⁺/PI⁺。

5. 对于细胞凋亡的定量测定，染色后的凋亡细胞也可以通过流式细胞术进行评估。

3. 线粒体膜电位检测

细胞凋亡被认为与线粒体通透性孔的开放和电化学梯度的丧失有关，线粒体跨膜电位 (ΔΨM) 的下降是细胞凋亡的指标。JC-1 染料是一种亲脂性阳离子染料，广泛用于检测多种细胞类型的 ΔΨM 变化。其原理为: 在具有较高 ΔΨM 的健康细胞中，JC-1 染料可进入细胞并在线粒体中积累，形成 J-聚集体 (Ex/Em=585/590 nm，橙红色荧光)。在凋亡细胞中，JC-1 染料进入线粒体较少，负性 ΔΨM 较低，保持 J 单体形式 (Ex/Em=510/527 nm，绿色荧光)。因此，通过共聚焦激光扫描显微镜或流式细胞术检测JC-1 的红/绿荧光比值，便可用于评估细胞凋亡状态。JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (HY-K0601) 是一种广泛使用的线粒体膜电位检测试剂盒^[5]。

JC-1 染色方案可参考如下方案^[6].

1. 在 6、12、24 或 96 孔板中以合适的密度培养您的实验细胞，并根据您的实验处理细胞。

2. 确保 JC-1 和 DMSO 已恢复室温，然后将瓶中内容物溶解在所提供的 DMSO 中制备浓度为 200 μM 的储备溶液。

3. 对于对照组，待试剂盒中所提供的的 CCCP 恢复至室温后，每孔添加 1 μL CCCP (50 mM)。在 37°C 下孵育细胞 5 分钟。

4. 每孔中加入 10 μL 的 JC-1 (200 μM)，使其终浓度为2 μM。37°C, 5% CO₂条件下避光染色细胞 15-20 分钟。

5. 对于共聚焦 (CLSM) 成像: 用 PBS 轻轻洗涤 3 次，加入新鲜无血清培养基。 通过 CLSM 成像在绿色和红色荧光通道中拍摄图像。JC-1 单体呈现绿色荧光 (Ex/Em=488/530nm)，JC-1 聚集体呈现红色荧光 (Ex/Em=543/590 nm)。

使用 MCE JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒的代表性图像

4. 凋亡相关标志物检测

如前所述，细胞凋亡途径最终均导致 caspase-3 的切割和激活。因此，可以通过 caspase-3 的检测来观察细胞凋亡过程。此外，细胞凋亡的其他生物标志物包括活化的 caspases 2/3/7/8/9、细胞色素 c、Bcl-2/Bcl-xl/Mcl-1、PARP 等。这些生物标志物可以通过多种方式检测，包括免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化^[8].

5. DNA 碎片检测

在凋亡细胞中，DNA 被核酸内切酶切割，细胞凋亡的后期会发生 DNA 片段化。从而导致了一个特征性的“DNA 阶梯” (在琼脂糖凝胶上显现)，阶梯中的每个条带大小相隔大约 180 个碱基对。通常来说，细胞凋亡形成的核酸内切酶裂解产物可以通过 DNA 阶梯技术或 TUNEL 染色法 (基于酶促末端标记的 DNA 链断裂) 来观察。一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒 (绿色荧光) (HY-K1078) 和 一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒 (红色荧光) (HY-K1079) 是广泛使用的 TUNEL 凋亡检测试剂盒^[1]。