乳腺癌模型

乳腺癌是全球女性中最常见的癌症之一。乳腺癌是一种异质性癌症，可分为四种亚型: Luminal A 型 (ER 阳性、HER2 阴性、低增殖)、Luminal B 型 (ER 阳性、HER2 阴性、高增殖)、HER2 阳性 (HER2 阳性、ER 和 PgR 阴性)，基底样型 (HER2、ER 和 PgR 阴性，也称为三阴性乳腺癌)^[1][2]。

虽然确切的发病机制尚不清楚，但据报道，基因突变、表观遗传改变、激素暴露和免疫微环境均与乳腺癌的进展有关^[2]。

首先，在基因突变方面，早期乳腺癌细胞中突变和扩增频率最高的基因是 TP53 (41%)、PIK3CA (30%)、MYC (20%)、PTEN (16%)、CCND1 (16%)、ERBB2 (13%)、FGFR1 (11%) 和 GATA3 (10%)。这些基因编码被抑制 (p53) 或激活 (Cyclin D1) 的细胞周期调节剂，从而维持增殖并抑制细胞凋亡。在 Luminal A 型中，肿瘤具有较高的 PIK3CA 突变率 (49%)，而在基底样型中存在较高的 TP53 突变率 (84%)。

其次，在表观遗传改变方面，基因可能会出现整体低甲基化或局部低甲基化。前者导致基因激活、癌基因上调和染色体不稳定，后者导致基因抑制和基因不稳定。其他表观遗传机制涉及通过 DNA 甲基化修饰组蛋白尾部。这种修饰会诱导染色质结构变化，从而沉默基因表达和核小体重塑。

第三，激素暴露也是导致乳腺癌的危险因素。具体而言，当雌激素与位于细胞核中的 ER 结合时，可能会促进癌变。例如，月经周期中雌激素和孕激素之间的失衡会增强细胞增殖，并导致 DNA 损伤，这可能会导致癌前病变，以及恶性细胞发生突变。

最后，包含多个细胞和细胞质基质 (ECM) 的微环境也可以影响乳腺癌的发生和发展。在癌变早期，免疫微环境通过活化的 CD8+ 和CD4+ T 细胞衍生的细胞因子发挥抗肿瘤作用。一旦肿瘤具有侵袭性，包括癌症相关成纤维细胞和细胞因子在内的微环境就会促进肿瘤生长，并被乳腺癌细胞“入侵”。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

乳腺癌动物模型主要包括移植瘤模型 (CDX 和 PDX 模型)、诱导模型 (化学、物理和生物学方法) 和基因工程模型 (转基因和基因敲除模型)^[3].

1. 移植瘤模型^[4]

移植瘤模型可分为细胞来源的异种移植模型 (CDX) 和患者来源的异种移植模型 (PDX)。CDX 和 PDX 模型可以通过皮下或原位注射来建立。皮下注射模型便于监测肿瘤生长，原位注射模型适用于研究肿瘤转移。

在 CDX 模型中，肿瘤细胞被移植到裸鼠体内。Luminal B 型细胞系 (BT474) 和三阴性乳腺癌细胞系 (MDA-MB-231, MDA-MB-435) 常被用于建立皮下 CDX 模型。在原位 CDX 模型中，肿瘤细胞被移植到 NOD/SCID 小鼠的乳腺脂肪垫上。常用于原位 CDX 模型的几种三阴性癌细胞系为 MDA-MB-231、MDA-MB-435、SUM1315，Luminal A 细胞系 为 MCF7 和 T47D。

而在 PDX 模型中，原发性乳腺癌肿瘤组织被植入免疫缺陷小鼠 (裸鼠、NOD/SCID 或 NSG 小鼠) 中。PDX模型能够模拟患者肿瘤的组织学、基因组特征和异质性，并预测药物反应。

PDX 模型 (皮下移植) 可参考下述建模方法^[5]

1. 将 NOD-SCID 或 NSG 小鼠饲养在无特定病原体 (SPF) 条件下。

2. 至少在小鼠在异种移植前一周进行 0.16 µg/mL 17β-Estradiol (HY-B0141) 饮水预处理。其中，含有 17β-Estradiol 的饮用水应保持新鲜 (每周更换一次)。

3. 经皮活检标本和治疗后手术标本应保存在冰上并在无菌 PBS 中运输。植入操作应在 1 小时内完成。

4. 将标本切成 4 mm³ 大小的碎片，用 14 号套管针将标本植入小鼠皮下。

5. 每个患者来源的样本可植入 2-5 只小鼠中 (取决于收到样本的质量和数量)。

6. 每天用游标卡尺测量肿瘤长度 (L)、宽度 (W) 和高度 (H)，记录肿瘤生长。肿瘤体积 (TV，mm³) 计算公式为 TV = π/6×L×W×H。

CDX 模型 (皮下移植) 可参考下述建模方法^[6]

1. 准备雌性无胸腺裸鼠 (5-8 周龄)。

2. 在 37 ℃，加湿，5 % CO₂ 培养箱中培养人乳腺癌细胞系。

3. 用冷PBS 收集培养的癌细胞，快速将细胞悬浮于冰冷的 Matrigel 中。

4. 给小鼠接种 100 μL 乳腺癌细胞。其中，MDA-MB-468 或 MDA-MB-453 的细胞悬液密度可分别参考 5 × 10⁶，1 × 10⁶。

5. 用游标卡尺测量长度 (L) 和宽度 (W)，记录肿瘤生长，每周三次。肿瘤体积 (TV，mm³) 计算公式为 TV = 0.5×L×W²。

2. 诱导模型^[3]

最常见的方法是通过给予 DMBA 或 MNU (化学方法)。DMBA (HY-W011845) 或 MNU (HY-34758) 一般在小鼠体内诱发腺瘤和 B 型腺癌的乳腺肿瘤。此外，还可使用辐射 (物理方法) 和慢病毒感染 (生物方法)。DMBA 或 MNU 通常通过静脉内、皮下或灌胃给药，施加于小鼠，SD 大鼠或 Fischer 344 大鼠。然而，SD 和 Lewis 大鼠对辐射刺激最敏感。生物学方法主要通过慢病毒在实验动物体内过表达癌基因或沉默抑癌基因。

DMBA 诱导模型可参考下述建模方法^[7]

1. 准备 55 日龄雌性 Charles foster 大鼠，体重 (150 ± 10 g)。

2. 新鲜制备剂量为 20 mg/mL 的 DMBA (用橄榄油稀释)，并通过口服灌胃法给药。

3. 从给予 DMBA 后第 4 周开始每周触诊大鼠，以检查肿瘤大小。

4. 第16周会出现肿瘤，DMBA 给药后第 18 周，所有大鼠均会出现肿瘤。

3. 基因工程模型^[3]

基因工程模型可分为转基因模型和基因敲除模型。

转基因模型通常使用启动子来实现癌基因在乳腺上皮细胞中的特异性表达，从而避免在其他器官中诱导肿瘤。最常用的启动子包括小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列 (MMTV-LTR) 和乳清酸性蛋白 (WAP) 启动子。MMTV 是一种导致小鼠乳腺肿瘤的重要病毒。乳腺特异性致癌基因包括 HER2/ERBB2、PyMT、Wnt、Myc、Ras 和 PIK3CA。例如，MMTV-PyMT 转基因小鼠在 4-8 周时出现明显的肿瘤，84%-90% 的小鼠在 14 周时发生肺转移。MMTV-Wnt-1 转基因小鼠在早期表现出广泛的导管增生，约 50% 的雌性转基因小鼠在 6 个月大时发展为乳腺癌。

除了转基因模型，肿瘤抑制基因 (如 p53、BRCA1/2 和 pTEN) 的敲除也可用于建立乳腺癌模型。乳腺组织特异性基因的敲除可以通过使用 Cre/loxP 重组酶系统以及MMTV-Cre/WAP-Cre 工具小鼠来实现。例如，p53 在控制基因组完整性和体内平衡方面至关重要。乳腺特异性 p53 敲除小鼠在 10 周后显示自发肿瘤，在 15-20 周后肿瘤会快速发展。

优点:

移植瘤模型: 周期短、成本低、变异少、成瘤率高。

诱导模型: 肿瘤发病率高，潜伏期短。

转基因模型: 靶点明确，动物免疫功能完好，与患者基因变异相似。

缺点:

移植瘤模型: 人源化小鼠模型昂贵，耗时，需要多学科专业知识。

诱导模型: 效率低，发病时间不同，病理特点不同。

转基因模型: 肿瘤组织学与患者不同，昂贵且耗时，基因编辑在几乎所有的乳腺导管上皮细胞中均会发生。

动物的肿瘤的数量、潜伏期和组织学类型可能受到年龄、繁殖史以及接触致癌物质时宿主内分泌环境的影响^[3]。