体细胞培养

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境 (无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法，细胞培养也叫细胞克隆技术。细胞培养是细胞和分子生物学中使用的关键工具，可以对细胞的生理学和生物化学进行建模^[1][2]。

细胞培养增值过程分为四个阶段：停滞期，对数期，平台期，和死亡阶段。细胞在接种后进入新的生长环境后，需要一段时间适应环境，停滞期细胞生长缓慢，由于培养基内营养丰富，细胞生长过程中排出的有害物质少，细胞很快从延滞期进入对数期，细胞生长呈现指数增长，呈现出快速生长状态。经过一段时间的高速生长繁殖后，培养基内部营养物质消耗越来越大，有害物质逐渐积累，细胞数量已占据可用基质、没有扩增空间时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止，则进入平台期，为了避免细胞进入死亡阶段，这时需要对细胞进行继续培养，以便细胞继续生长，并且刺激其进一步增殖。

停滞期：细胞从传代培养中恢复，附着在表面并开始扩散。

对数期：细胞呈指数增长，并以定义细胞系倍增时间的特征速率加倍。

平台期：培养物汇合，细胞生长减慢甚至停止。

死亡阶段：细胞开始死亡并从表面分离。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

不同的细胞有不同的培养要求，为了达到最佳的生长效果，需要在体外模拟体内环境，营造出细胞培养适宜的环境，可借助外在条件来满足。

• 合适的细胞培养基

培养基是培养环境中最重要的组成部分，因为它为细胞生长提供了必要的营养、生长因子和激素，并调节培养物的 pH 值和渗透压^[4]。

• 优质血清

血清是细胞培养过程中重要的营养物质，同时也对细胞起到一定的保护作用。血清来源于动物，且含有细胞培养中所需的各种营养 (血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等)。血清能够调节细胞膜的通透性，提供促接触和生长因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。目前血清种类有很多种 (例如猪，兔，马，羊等)，但胎牛血清 (FBS) 仍然是使用最广泛的血清，FBS可提供丰富的促进细胞体外发育和增殖的生长因子，是哺乳动物细胞培养最广泛使用的培养基补充物^[5][6]。

• 恒定的细胞生长温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同，细胞培养的最佳温度主要取决于分离来源的细胞宿主的体温^[7]。

• 合适的气体环境

细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的 pH 有关，4-10% 浓度的CO₂ 适用于大多数细胞培养实验。

大多数细胞大多数细胞为贴壁依赖性细胞，必须附着于固体或半固体基质上培养 (贴壁培养或单层培养)，而另一些细胞则可在培养基中漂浮生长 (悬浮培养)。

• 贴壁细胞传代

1) 拿出一瓶或一皿长势良好的细胞 (细胞密度达到 70-90% 为最佳)；

2) 使用无菌吸管把细胞上层培养基吸出；

3) 使用不含钙和镁的平衡盐溶液洗涤细胞，倾斜培养瓶或培养皿，缓慢将平衡盐溶液加进去，覆盖细胞即可，画十字交叉清洗，吸取废液，重复洗涤 2-3 次

4) 加细胞解离试剂，覆盖细胞 0.5 mL 即可，将培养瓶或培养皿放置在细胞培养箱中，实际孵育时间随所用细胞系而异，控制细胞解离试剂的时间很重要，时间过短细胞依旧是贴壁状态，处理时间过长会损坏细胞表面的蛋白；

5) 培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，终止消化；

6) 轻轻倾斜倾斜培养瓶或培养皿，将吸出细胞解离试剂，再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化；

7) 用无菌吸管吸取培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液，吹打时动作要轻柔不要用力过猛。

8) 将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，离心 800-1000 rpm，5 min；

9) 弃去上清，加新的完全培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；

10) 用细胞计数板进行计数，分别接种在新的培养瓶或培养皿内。

• 悬浮细胞传代

悬浮细胞传代过程比贴壁细胞简单易操作，悬浮细胞生长在培养基中，无需使用细胞解离试剂从容器表面解离下来，整个过程更快，对细胞的损伤更小。对于悬浮细胞，可以直接换液处理，也可以直接稀释培养瓶中的细胞并使其继续扩增。

1) 拿出一瓶或一皿长势良好的细胞，将细胞悬液转移到转移到 15 mL 离心管中，离心 800-1000 rpm，5 min；

2) 弃去上清，加新的完全培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；

3) 用细胞计数板进行计数，分别接种在新的培养瓶或培养皿内。

1. 胰蛋白酶要预温，温度 37℃ 左右为宜。

2. 离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。

3. 要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。