4,5-Diaminofluorescein  (Synonyms: DAF-2)

4,5-Diaminofluorescein is a fluorescent detector for nitric oxide (NO) in cells and tissues^[1].

4,5-Diaminofluorescein 实验步骤^[2]
1. 准备工作
1.1 溶液配制：
1) L-精氨酸储备液：将 L-精氨酸溶解于水中，配制成 100 mM 的溶液 (0.021 g/ml)。
2) A23187 储备液：将 1 mg A23187 溶解于 191 µL DMSO 中，配制成 10 mM 的溶液，储存于 -20°C。3) DAF-2 储备液：产品运输时为 5 mM 的 DMSO 溶液，分装后冷冻保存于 -80°C。
4) PBS+Ca²⁺ 溶液：KH₂PO₄ 1.47 mM；
Na₂HPO•7H₂O 9.57 mM；NaCl 137.00 mM；
MgSO₄•7H₂O 0.49mM； CaCl₂•2 H₂O 0.90 mM。将 CaCl₂ 溶解于 1L 水中，其他成分溶解于另 1 L 水中，小心混合两种溶液并调节 pH 至 7.4，因为 DAF 衍生物的荧光强度与 pH 值相关，所以需严格控制 pH 值。
1.2 实验前准备：
1) 将水浴和干燥箱/培养箱预热至 37°C。
2) 向 PBS+Ca²⁺ 溶液中添加 L-精氨酸储备液 (100mM)，使其终浓度为 100 µM，即按照 1:1000 的比例添加，然后在 37°C 水浴中预热该溶液。
3) 将 A23187 储备液 (10 mM) 用 DMSO 按 1:5 的比例稀释。将 DAF-2 储备液 (5 mM) 用添加了 L-精氨酸的 PBS+ Ca²⁺ 溶液按 1:250 的比例稀释，并将其置于冰上的避光盒中保存，直至使用。
4) 启动荧光分光光度计软件。在暗室中将比色皿、冲洗用水和废液缸带到荧光分光光度计处，准备处理样品。
注意：所有涉及 DAF-2 的操作均需在暗室中进行！在将样品运输至荧光分光光度计的过程中，务必确保样品避光！
2. 正式实验：
1) EA.hy 926 细胞培养
2) 移除 EA.hy 926 细胞上清液，用 1 mL PBS+Ca²⁺ 溶液洗涤细胞两次。
3) 用 2 mL 添加了 L-精氨酸的 PBS+Ca²⁺ 溶液孵育细胞 5 min，温度为 37°C，使细胞与特定浓度的 L-精氨酸达到平衡状态。
4) 添加 1 µL 稀释后的 A23187 溶液 (最终浓度为 1 µM)。添加 10 µL 稀释后的 DAF-2 溶液 (最终浓度为 0.1 µM)。再次将细胞在 37°C 黑暗环境中孵育 5 min，在此期间释放的 NO 会与 DAF-2 反应生成 DAF-2T。
5) 迅速将细胞上清液转移至 2 ml 塑料盖中，确保所有样品的反应时间一致。
6) 尽快在标准比色皿中测量细胞上清液的荧光强度。在测量完成前，确保所有样品都得到良好的避光保护。测量时，激发波长应在 490-495nm 之间 (需根据具体情况进行验证)，发射波长为 515 nm，发射和激发狭缝宽度均为 10nm，灵敏度应尽可能选择高的设置。同时测量不含细胞的孔，用于计算 DAF-2 的自发荧光。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

362.34

C₂₀H₁₄N₂O₅

205391-01-1

固体

Brown to black

538

485

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

-20°C, protect from light

*In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)

* 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限：-80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light)。-80°C储存时，请在6个月内使用，-20°C储存时，请在1个月内使用。

• [1]. Jourd'heuil D. Increased nitric oxide-dependent nitrosylation of 4,5-diaminofluorescein by oxidants: implications for the measurement of intracellular nitric oxide. Free Radic Biol Med. 2002 Sep 1;33(5):676-84.  [Content Brief]

  [2]. Räthel TR, et al. Application of 4,5-diaminofluorescein to reliably measure nitric oxide released from endothelial cells in vitro. Biol Proced Online. 2003;5:136-142.  [Content Brief]