5(6)-FITC  (Synonyms: Fluorescein 5(6)-isothiocyanate; Fluorescein isothiocyanate 5- and 6- isomers)

5(6)-FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) is an amine-reactive derivative of a fluorescent dye, characterized by high absorbance and excellent fluorescence quantum yield. The isothiocyanate group of FITC can react with various functional groups on proteins, including amines, thiols, imidazoles, tyrosines and carbonyls, enabling the labeling of proteins such as antibodies and lectins. 5(6)-FITC has a wide range of applications, including flow cytometry, immunofluorescence, protease assays and conjugation. The maximum excitation/emission wavelengths are 492/518 nm^[1][2][3][4].

储存液制备^[1]
在丙酮或 DMSO 中制备 1 mg/mL 5(6)-FITC 储备溶液，并储存于 0℃。
工作液制备：在磷酸盐缓冲液 (PBS) 中制备 2.5 pg/mL，PH 调至 7.8。
5(6)-FITC 用于流式细胞术检测^[1]
(1) 细胞准备：用 10 mL PBS 将细胞从固体营养琼脂板上洗净，在 2000 g 下离心 30 min，然后用 10 mL 70% 乙醇重悬，4℃ 孵育。
(2) 染色：取 3×10⁵ 细胞并离心，将细胞在 2.5 pg/mL 的 5(6)-FITC 中重悬，在 4℃ 下染色 45min。
(3) 上机：用流式细胞仪进行检测绿色荧光的比例。
5(6)-FITC 用于蛋白酶测定^[2]
(1) 将 1 g 酪蛋白溶解在 100 mL 的溶液中，该溶液含有 50 mM 碳酸钙和 150 mM 氯化钠，pH值为 9.5。可以先将溶液加热至沸腾，然后冷却至室温。
(2) 加入 40 mg 5(6)-FITC，室温下轻轻搅拌 1 h。
(3) 通过透析去除游离的 5(6)-FITC，首先在 4°C 下用 2 L 含活性炭的水透析，然后用 pH 8.5 的 50 Mm Tris 缓冲液透析，最后用 pH 7.2 的 50 mM Tris 缓冲液透析。
(4) 使用 pH 7.2 的 50 mM Tris 缓冲液将蛋白质浓度调整为 0.5%。底物分装成 5 mL 每份，冷冻保存在 -20°C，可稳定保存 1 年。
(5) 通过测量底物在 490 nm 处的吸光度，使用 Lowry 法测量蛋白质含量，确定每个酪蛋白分子上有 0.65 个 FITC 残基。
(6) 使用 FTC-酪蛋白进行反应。反应混合物包含 10 μL 酶、20 μL 测定缓冲液和 20 μL 0.5% 的 FITC-酪蛋白。
(7) 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶：测定缓冲液为 pH 7.8 的 100 mMTris 缓冲液，含 10 mM CaCl2; 或 pH 7.8 的 100 mM 磷酸盐缓冲液，含 150 mM NaCl。
(8) 枯草杆菌蛋白酶：测定缓冲液为 pH 7.6 的 20 mM 磷酸盐缓冲液，含 150 mM NaCl。
(9) 热稳定性蛋白酶：测定缓冲液为 pH 7.8 的 100mM Tris 缓冲液，含 10 mM CaCl2。
(10) 弹性蛋白酶：测定缓冲液为 pH 8.8 的 20 mM 硼酸盐缓冲液，含 150 mM NaCl。
(11) 充分混合后，将溶液在 37℃ 摇床水浴中孵育 5 min 至 24 h。孵育大于 3 h 可加入 0.2% 叠氮化钠防止细菌生长。
(12) 反应通过加入 120μL 5% 三氯乙酸 (TCA) 并充分混合来终止。试管在室温下静置至少 1 小时。将试管回收并在 4°C 下过夜保存。通过离心 5 分钟,沉淀 TCA 不溶性蛋白质。取上清液 60 μL，用 pH 8.5 的 500 mM Tris 缓冲液稀释至 400 μL 或 3 mL，并充分混合以确保整个样品达到适当的 pH 值。
(13) 荧光测定使用激发波长 365 nm 或 490 nm，发射波长 525 nm。重复测量的平均值。使用单个值计算相关系数 r 和回归线的标准误差 S。
(14) 胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和热稳定性蛋白酶对 FTC-酪蛋白的裂解与酶浓度呈线性关系。
免疫荧光检测血小板上 FITC 标记抗体^[3]
(1) 富血小板血浆 (PRP) 制备：将血液在 22°C 下以 180 × g 离心 8 分钟，分离出富血小板血浆。
(2) 血小板收集: 将 PRP 在 22°C 下以 1800 × g 离心 10 分钟，收集血小板。红细胞和白细胞的污染少于 0.5%。
(3) 血小板洗涤: 用 PBS 在 22°C 下以 1800 × g 离心 10 分钟洗涤血小板两次，然后将血小板重悬于 PBS 中。
(4) 纯化人 IgG: 人 IgG 通过 DEAE 纤维素层析从正常人血清中纯化。
(5) 使用 FITC 标记的山羊抗人 IgG 抗体: 总蛋白浓度为 6.2 mg/mL，荧光素/蛋白摩尔比为 2.6，特异性抗体浓度为 1.6 mg/mL。
(6) 将 FITC 标记的抗人 IgG 山羊抗体加入到含有 8.0 × 10⁸ 个细胞 /mL 的 0.5 mL 血小板悬浮液中，最终浓度为 1.0 × 10^-7M。在 22°C 下孵育 20 分钟后，用 PBS 洗涤血小板两次并重悬于 PBS 中。然后加入 SDS (1.5 mg/mL)，并通过荧光法测定结合的抗人 IgG 抗体，激发波长为 493 nm，发射波长为 516 nm。
5(6)-FITC 与 PAMAM G4 偶联^[4]
(1) 将 30 μL (3 mg) 的 PAMAM-G4 树状大分子溶解在 10 wt% 的甲醇溶液中，加入到 250 μL 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (pH 8.5) 中。
(2) 将混合液与 1mg 5(6)-FITC 共同孵育，5(6)-FITC 溶于 60 μL 干燥的 DMSO 中，在室温下孵育 1 小时。
(3) 偶联了 FITC 的 PAMAM-G4 树状大分子通过凝胶过滤法使用含有 Sephadex G25 的 PD-10 脱盐柱进行纯化。以 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (pH 8.5) 作为流动相，收集 0.5 mL 的组分。
注意事项
1. 5(6)-FITC 对光及湿度敏感。即用即配 5(6)-FITC 溶液并丢弃未使用的部分。
2. 低浓度的叠氮化钠 (≤3 mM 或 0.02％) 或硫柳汞 (≤0.02 mM 或 0.01％) 不会显著干扰蛋白标记; 但是 20-50％ 的甘油会降低标记效率。
3. 避免使用含伯胺 (例如 Tris，甘氨酸) 或铵离子的缓冲液，它们与待标记蛋白竞争反应。
4. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

389.38

C₂₁H₁₁NO₅S

27072-45-3

固体

Yellow to orange

525

488

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

-20°C, protect from light

*该产品在溶液状态不稳定，建议您现用现配，即刻使用。

* 请根据产品在不同溶剂中的溶解度，选择合适的溶剂配制储备液；该产品在溶液状态不稳定，建议您现用现配，即刻使用。

• [1]. J S Miller , ET AL. Flow cytometric identification of microorganisms by dual staining with FITC and PI. Cytometry. 1990;11(6):667-75.  [Content Brief]

  [2]. S S Twining, et al. Fluorescein isothiocyanate-labeled casein assay for proteolytic enzymes.Anal Biochem. 1984 Nov 15;143(1):30-4.  [Content Brief]

  [3]. K Sugiura, et al. A simple quantitative immunofluorescence assay for FITC-labeled antibody on platelets. J Immunol Methods. 1981;40(2):165-70.  [Content Brief]

  [4]. Natalia Oddone, et al. Cell uptake mechanisms of PAMAM G4-FITC dendrimer in human myometrial cells. J Nanopart Res. 2013 15:1776.