Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Live & Dead Cells (Calcein/PI) 

活死细胞活力/毒性检测试剂盒 (Calcein/PI)

钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 是钙黄绿素的乙酰氧甲基酯，具有高亲脂性和细胞膜渗透性。钙黄绿素-AM 本身无荧光，但在活细胞中，通过细胞内酯酶的水解作用，钙黄绿素-AM 可被转化为具有强绿色荧光的钙黄绿素 (Ex/Em = 490 nm/515 nm)。因此，钙黄绿素-AM 只能用于活细胞的染色，能够特异性地反映细胞活性状态。

碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 是一种无法穿透完整细胞膜的红色荧光染料。细胞死亡后，PI 能进入细胞并与细胞核中的双链 DNA 特异性结合，从而发出红色荧光 (Ex/Em = 535 nm/617 nm)。

MCE 活/死细胞活力毒性检测试剂盒 (Calcein/PI) 可以同时对活细胞和死细胞进行双重荧光染色，用于细胞活性与细胞毒性的检测。使用 490 nm 激发时，可通过荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞；而使用 545 nm 激发时，仅能观察到死细胞。

本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪等各种荧光检测系统。

本品适用于大多数哺乳动物细胞的检测。由于真菌和细菌有细胞壁，会阻碍钙黄绿素-AM 进入细胞，因此不适用于细菌和真菌检测。

-20ºC，1 年

避光保存

由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，建议进行预实验摸索钙黄绿素-AM 和碘化丙啶染色液的最佳浓度。

1. 死细胞制备：将细胞在 70% 乙醇中培养 30 min 或在 0.1% 皂苷培养 10 min。

2. 试剂准备：取出碘化丙啶和钙黄绿素-AM 的染色液，室温平衡 30 min。

3. 碘化丙啶染色：用检测缓冲液配制几个不同浓度碘化丙啶工作液 (0.1 - 10 μM)，对死细胞进行染色，。确定碘化丙锭的染色浓度，该浓度可对细胞核染色而细胞质未染色。

4. 钙黄绿素-AM 染色：用检测缓冲液配制几个不同浓度钙黄绿素-AM 工作液 (0.1 - 10 μM)，对死细胞染色。确定钙黄绿素-AM 的染色浓度，该浓度不可对细胞质染色，随后用钙浓度染色液对活细胞染色，验证活细胞可被成功染色。

碘化丙啶和钙黄绿素-AM 推荐染染色浓度为 0.1 - 10 μM，可根据预实验的最佳浓度来配制染色工作液。

以下以 2 μM 钙黄绿素-AM、8 μM 碘化丙啶为例

1. 试剂准备：取出碘化丙啶和钙黄绿素-AM 的染色液，室温平衡 30 min。

2. 染色工作液配制：在 10mL 的检测缓冲液中加入 5 μL 的碘化丙啶染色液和 5 μL 的钙黄绿素-AM 染色液，充分混匀得到的染色工作液即可直接用于染色。

贴壁细胞染色

1. 将贴壁细胞接种至细胞培养板、微孔板或制成细胞爬片。

2. 根据实验设计处理细胞后，用 PBS 洗涤细胞 2 - 3 次，充分除去培养基中残留的活性酯酶。

3. 加入足量染色工作液，保证单层细胞被充分覆盖。

4. 37 ºC 孵育 15 - 30 min。

悬浮细胞染色

1. 根据实验设计处理细胞后，1,000 rpm 离心 3 min，弃上清收集细胞。

注：建议细胞量为 1 × 10⁴ - 1 × 10⁵。

2. 细胞沉淀用 PBS 洗涤 2 - 3 次，充分除去培养基中残留的活性酯酶。

3. 细胞沉淀用 100 μL 染色工作液重悬，细胞密度为 1 × 10⁵ - 1 × 10⁶ 个/mL。

4. 37 ºC 孵育 15 - 30 min。

荧光显微镜检测

1. 贴壁细胞：对于培养孔板中的细胞，吸弃染色工作液终止染色，用 PBS 洗涤细胞 2 - 3 次，加入足量的检测缓冲液，充分覆盖单细胞层即可观察；对于细胞爬片，在干净的载玻片上滴加 10 μL 检测缓冲液充分覆盖细胞爬片即可观察。

2. 悬浮细胞：在干净的载玻片上滴加 10 μL 已染色的细胞悬液，可用指甲油进行密封，防止水分蒸发。

3. 荧光显微镜检测：用荧光显微镜在 490 ± 10 nm 激发波长下同时观察活细胞（黄绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。另外使用 545 nm 激发波长单独观察死细胞。

荧光酶标仪检测

1. 根据实验要求准备对照组，对照组与实验组均进行上述染色工作液的配制及染色步骤。

实验组设置：A、B

对照组设置：死细胞对照组 (C、D)、活细胞对照组 (E、F)、无细胞对照组 (G、H)。

2. 贴壁细胞：可直接检测。

3. 悬浮细胞：将染色好的细胞悬液以每孔 100 μL 接种至微孔板中。

注：每孔最低检测细胞量为 200 - 500 个，最大检测细胞量为 1 × 10⁶ 个。

4. 荧光酶标仪检测：设置合适的激发和发射波长收集样品数据。

5. 分析与计算

流式细胞仪分析

悬浮细胞或胰酶消化后的贴壁细胞均进行上述染色工作液的配制及染色步骤，染色后的细胞悬液即可直接上机检测。

1. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2. 钙黄绿素-AM 潮湿易分解，首次使用时建议适当分装并 -20ºC 密封保存。

3. 钙黄绿素-AM 在水溶液中不稳定，检测工作液须现配现用，不能配制后冻存。

4. 培养液中的血清和酚红可能会对钙黄绿素-AM 的染色产生影响，造成荧光背景增强，建议在加入钙黄绿素-AM 检测工作液前适当洗涤细胞。

5. 碘化丙锭对人体有害，操作时务必小心。

6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。