实验操作 | Western Blot 实验步骤 + 不可忽视的小细节（全）

在之前的分享中，小 M 为大家带来了“怎么做 Western blot? 看这一篇就够了！”和“WB 常见问题及解决方案”两篇推文。然而实际操作时，许多朋友发现仍会遇到各种各样的问题，本期小 M 跟您聊一聊 WB 的具体实操，以及每一个成功的 WB 实验背后容易被忽视，但却至关重要的小细节！

首先，我们来回顾下整个 WB 流程：蛋白样本制备 → 电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵育一抗 → 孵育二抗 → 显影 → 分析。

图 1. Western blot 的流程图^[1]。

▐ 1. 总蛋白提取

(1) 准备溶液

(2) 不同样本

对于贴壁细胞： 4℃ 预冷的 PBS 洗 2~3 遍，用细胞刮子刮下细胞，或用胰蛋白酶处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

细胞样品按 1×106 细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min (或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s)。组织样品转移匀浆液于 1.5 mL EP 管中，置于冰上裂解 15 min；

（1）制备好 BSA 标准品，并将 BCA 试剂 A 液: B 液=50:1 配制适量 BCA 工作液，样品用预冷 PBS 进行稀释；

（4）酶标仪 562 nm 波长读取各孔 OD 值；

（5）根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

▐ 1. 制胶（使用预制胶板请忽略此步骤）

(1) 准备玻璃板，确保两块玻璃板下缘水平且均无豁口，安装时内长外短，用手压实玻璃板及垂直槽制胶架。

▐ 2. 制样

▐ 3. 跑胶

（1）根据 BCA 测定结果，目的蛋白每孔上样量 20 μg-40 μg，内参蛋白每孔上样量 5 μg-10 μg；

（2）电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，80 V，约 30 min；

（3）溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，120 V，至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

(1) 准备转膜缓冲液：

提前配制好转移缓冲液并预冷至 4 ℃；

转膜完成后，取出 PVDF 膜，用 TBST 冲洗膜表面，进行封闭等后续步骤。

室温下，将转好的膜于摇床上用 5% 的脱脂牛奶 (TBST 配制)，磷酸化蛋白检测用 5% 的 BSA (TBST 配制) 缓冲液，室温封闭 1-2 h。

(1) 孵育一抗：稀释一抗 (TBST 溶解的 5 % 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA)，4℃ 过夜孵育。

内参在实验中扮演着至关重要的角色，想要挑选出靠谱的内参抗体？你需要遵循以下三个法则：

一、样本来源与特性

1. 样本种属来源：哺乳动物样本可选择 GAPDH、β-Actin 等；植物样本则选择 Plant Actin、Rubisco 等；

对于研究较少的样本类型，可查阅相关文献以获取合适的内参蛋白推荐。例如：Shiyang Li 等人发现 gatB 基因是猪肺炎支原体最合适内参基因[4]。

2. 样本组织特性：不同组织细胞的结构和功能有所差异，应选择在该组织中稳定表达的蛋白作为内参。

为了确保目的蛋白与内参蛋白能够清晰区分，所选内参蛋白的分子量应与目的蛋白相差至少 5 kDa 以上。（方便在同一张膜上同时孵育内参抗体与目的蛋白抗体，更精确地反映样本间的表达差异）

举例来说，当目的蛋白的分子量为 45 kDa 时，可以优先选择 GAPDH 或 β-Tubulin。GAPDH 的分子量约为 36 kDa，与 45 kDa 的目的蛋白相差足够大，可以清晰地区分开。

 Tips:（滑动查看） 

(1) 在避光环境中，将 ECL 化学发光试剂 A 液、B 液 1:1 配置，充分混匀；

(2) 将 PVDF 膜置于化学发光成像仪载物台上;

(3) 用移液器吸取适量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上;

(4) 推入载物台，设置曝光时间进行图片采集 (可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。

 

 

WB 实验虽然看似简单，但其中蕴含的学问却不少。只有当我们真正掌握了每一个细节，并严格按照实验步骤进行操作时，才能获得准确、可靠的结果。希望今天的分享能够为大家在 WB 实验的道路上提供一些帮助~最后，小 M 衷心祝福使用 MCE 抗体产品的科学汪们: 高分文章发不停，基金中到数不清！