肝癌模型

肝癌可分为原发性肝癌和继发性肝癌。继发性肝癌是指转移性肝癌。原发性肝癌包括肝细胞癌 (HCC)、肝内胆管癌 (ICC) 和纤维板层 HCC。值得注意的是，HCC 是最常见的形式，约占原发性肝癌的 90%^[1]。

诱发肝癌的危险因素很多，如酒精、乙型肝炎病毒 (HBV) 或丙型肝炎病毒 (HCV)、非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)^[1]。HCC 通常由慢性肝病演变而来，遵循“正常肝-肝损伤-慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”的病理变化过程^[2]。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

HCC 小鼠模型包括化学毒性试剂诱导模型、移植瘤模型和基因工程模型。

• 1. 化学毒性试剂诱导模型

化学毒性试剂诱导 HCC 肿瘤发生的机制有如下两种: 直接 DNA 损伤或促进癌前细胞生长。毒性试剂一般通过腹腔注射 (i.p.) 或灌胃给药。二乙基亚硝胺 (HY-N7434) (DEN)、黄曲霉毒素 B1 (HY-N6615)、四氯化碳 (CCl₄) 是诱导 HCC 的常见毒性试剂^[3]。在这些毒性试剂中，DEN 几十年来一直被用于诱导小鼠 HCC。DEN 诱导的 HCC 模型从嗜碱性病灶、增生性结节、肝细胞腺瘤逐步发展为最终的 HCC^[4]。DEN 可以单独使用或与其他化学毒性试剂联合使用。

DEN 诱导的 HCC 模型可参考如下步骤^[5]。

1. 准备 Swiss albino 小鼠 (3 周龄)，自由进食、饮水。

2. DEN 以 15 mg/kg 的剂量 (溶解在生理盐水中，i.p.，单次) 给药，从而启动肝癌的发生。

3. CCl₄ 以 1.6 g/kg 的剂量 (与玉米油 1:1 稀释，口服灌胃，整个实验期间每周 3 次) 给药，从而刺激肝细胞增殖和再生。

4. 对照组给予单次生理盐水 (i.p.)，并每周灌胃 3 次玉米油。

优势: 可模拟癌症的发生过程，肿瘤生长在自然微环境中。

缺点: 难以监测肿瘤大小变化，诱导模型的时间因小鼠的给药剂量、性别、年龄和品系而异。

• 2. 移植瘤模型

移植瘤模型通常通过皮下注射人源癌细胞系如 HepG2、Hep3B 和 Huh7 细胞 (细胞系来源的异体移植肿瘤模型, CDX)，或通过将病人肿瘤组织 (患者来源的异体移植瘤模型, PDX) 植入免疫缺陷小鼠的肝脏来建立。CDX 和 PDX 模型都可以通过异种移植和原位移植建立。 异种移植是通过将人源 HCC 细胞系或肿瘤组织注射到小鼠皮下来建立，原位移植是通过直接将 HCC 肿瘤细胞或组织注入小鼠的肝脏或脾内注射，原位移植通常需要外科专家操作^[4]。

PDX 模型 (异种移植) 可参考如下步骤^[6]。

1. 去除坏死组织: 将新鲜的肿瘤组织快速置于冰冷的含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素的高糖 DMEM 中。

2. 去除坏死组织后，在无菌条件下，用 10 号手术刀将肿瘤标本分成 2×1×1 mm³ 的切片。

3. 用冰冷的 PBS 缓冲液清洗切片 3 次。

4. 在添加有 50% Matrigel、10 ng/mL 表皮生长因子、10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素的 DMEM 培养基中孵育组织切片 30 min。

5. 将培养的肿瘤组织用 20 号套管针移植到雄性非肥胖、糖尿病、严重联合免疫缺陷 (NOD/SCID) 小鼠 (4-5 周龄) 右侧胁腹皮下。

6. 用游标卡尺测量长度 (L) 和宽度 (W)，记录肿瘤生长，每周三次。肿瘤体积 (TV，mm³) 计算公式为 TV = 0.5×L×W²。

CDX 模型 (异种移植) 可参考如下步骤^[7]。

1. 准备 4 周龄、雌性、无胸腺 BALB/c 裸鼠，平均体重约 22 g。在 25 ℃ 和 55% 湿度、无菌、12 小时黑暗/光照循环的条件下饲养，所有小鼠都可以在笼中自由进食和饮水。

2. 在 RPMI 1640、10% FCS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素培养基中培养人源 HCC HepG2 细胞系，并置于 37 ℃，5% CO₂ 培养箱中。

3. 收集所培养的 HepG2 细胞，用冰冷的 PBS 快速将细胞悬浮于冰冷的基质胶中。

4. 将细胞 (1.0×10⁷ 个细胞，200 μL) 注射到小鼠左侧腹股沟区皮下，从而建立实体瘤模型。

5. 用游标卡尺测量长度 (L) 和宽度 (W)，记录肿瘤生长，每周三次。肿瘤体积 (TV，mm³) 计算公式为 TV = 0.5×L×W²。

优点:

异种移植: 诱导简单，周期短，肿瘤大小和位置可控。

原位移植: 肿瘤发生于肝脏自然微环境中，可模拟 HCC 的病灶转移。

缺点:

异种移植: 缺少肿瘤微环境。

原位移植: 外壳手术复杂且昂贵，手术需要外科专家来操作。

• 3. 基因工程模型

基因工程模型可通过致癌基因的激活或抑癌基因的失活而诱导肿瘤形成。下面列出了常用和文献验证过的遗传模型^[8]。

c-Myc 过表达

c-Myc 的激活与 HCC 的癌变高度相关。肝脏中特异性过表达 c-Myc 的转基因小鼠可以产生肝肿瘤，潜伏期相对较长，为 12-15 个月。肿瘤发生率: 45 周龄时约为 40%，55 周龄时约为 60%，65 周龄时约为 80%。HCC 的表型可通过 HE 染色和 MR 成像显示。

P53 敲除

p53 在控制基因组完整性和稳态方面起着关键作用。P53 基因肝脏特异性敲除增加了小鼠肝细胞和肝祖细胞的增殖率，并在门静脉周围肝区显示出 LPC 样细胞。

Pten 敲除

Pten 的磷酸酶活性会抑制 PI3K，从而抑制下游 PKB/Akt 和 mTOR 信号传导。Pten 敲除小鼠可从肝肿大和脂肪变性发展为肿瘤。44 周龄时 47% 的动物发展为肝腺瘤，到 74-78 周龄时，66% 的动物发展为 HCC。

优点: 适合研究肿瘤的生物发生过程。

缺点: 操作程序容易受到实验专业程度的影响，可能会影响胚胎发育，肿瘤潜伏期长，成瘤率较低。

1. 在 DEN 诱导的 HCC 模型中，通常较年轻的小鼠由于肝细胞增殖率较高，因而 HCC 发展较快。如果将 DEN 注射到 2 周龄以下的小鼠体内，单独使用 DEN 就会导致 HCC 的发展。如果用老年小鼠，可能需要额外的刺激，例如苯巴比妥^[4]。

2. 在异种移植中，需要使用免疫功能低下的小鼠以避免异种组织的排斥。此外，小鼠来源的细胞系或肿瘤可能无法完全代表人类疾病^[4]。